Практическая работа № 5-6 Питательные среды

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

• среды для определения протеолитической активности (мясопептонный желатин, молочный агар, обезжиренное молоко и др.);

• среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо, Левина, Плоскирева и др.);

• среды для определения гемолитической способности (кровяной агар и другие среды с добавлением крови животных);

• среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов (среда Вильсон-Блера);

• селективные среды, применяемые для дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий (синтетические среды).

Классификация питательных сред по назначению является в какой-то мере условной. Так, обезжиренное молоко по отношению к молочнокислым бактериям является средой накопления и одновременно его можно, использовать для изучения протеолитической активности гнилостных бактерий.

Техника приготовления питательных сред, их стерилизация и проверка на стерильность

Жидкие и желатиновые питательные среды фильтруют через фильтровальную бумагу, среды с агаром - через ватно-марлевый фильтр. Перед фильтрованием монтируют вспомогательную установку. В кольце универсального штатива закрепляют воронку, под трубку ее подставляют приемник для фильтрата.

Ватно-марлевые фильтры для агаровых сред готовят следующим образом. Стеклянную воронку покрывают квадратным куском марли, углы которой перегибают через край воронки. На марлю кладут слой гигроскопической ваты. Перед началом фильтрования поверхность ватно-марлевого фильтра, так же как и бумажного, осторожно смачивают дистиллированной водой или фильтруемой средой. Питательные среды с желатином и агаром предварительно перед фильтрованием расплавляют и подогревают до кипения.

Осветление питательных сред применяют в том случае, когда в процессе приготовления они мутнеют и приобретают темный цвет. Осветление может быть основано на коагуляции взвешенных частиц, что способствует более быстрому выпадению их в осадок, и на адсорбции, т.е. способности различных веществ осаждать на свою поверхность взвешенные частицы.

Существует несколько способов осветления питательных сред.

1 К 1 дм³ среды, охлажденной до температуры 50 °С, прибавляют один белок свежего куриного яйца, взбитый в пену, с двойным объемом холодной воды. После добавления белка среду хорошо размешивают и кипятят на сильном огне в течение 10 мин или нагревают в автоклаве в течение 30 мин при температуре 105 °С, затем фильтруют.

2. В питательную среду, охлажденную до температуры 40 – 45 °С, вносят на каждый литр среды 20 – 30 г мяса, пропущенного через мясорубку и растертого в ступке с бульоном до получения однородной массы. Среду с прибавленной к ней мясной кашицей тщательно размешивают и помещают на 1 ч в текучепаровой аппарат Коха, а после этого фильтруют.

3. Фильтрацию и осветление агара можно заменить декантацией, т. е. отделением осадка его отстаиванием. Для этого расплавленную среду с агаром наливают в широкий сосуд высоким слоем и ставят в горячий автоклав на ночь для осаждения взвешенных частиц, обусловливающих мутность среды. На следующий день посуду с застывшим агаром слегка подогревают в водяной бане, перевертывают вверх дном, встряхивают агар и срезают придонную часть его, содержащую осадок.

Розлив питательных сред после осветления и фильтрации осуществляют в колбы, флаконы, пробирки или матрицы. Среды, ранее простерилизованные, а также стерилизуемые текучим паром или при давлении 0,05 МПа, разливают в стерильную посуду; среды, подлежащие стерилизации при давлении 0,1 МПа – в чистую нестерильную посуду.

При розливе сред края сосудов нельзя смачивать питательной средой, так как ватно-марлевые пробки, которыми закрывают пробирки и колбы перед стерилизацией, приклеиваются к стеклу.

Ватные пробки обычно готовят из гигроскопической ваты, которая несильно тлеет, лучше обеспечивает стерильность субстрата в посуде. Длина пробки не более 3 см; она должна свободно входить в пробирку на 1,5 – 2 см, достаточно плотно закрывая ее. В некоторых случаях пробки обшивают марлей. Для изготовления пробки берут четырехугольную пластинку ваты, загибают края и закручивают валиком.

Поверх ватно-марлевой пробки на колбы и флаконы с питательными средами надевают бумажные колпачки.

Розлив плотных стерильных питательных сред в чашки Петри проводят при необходимости поверхностного посева. Плотную питательную среду (агар, желатин) во флаконах или пробирках расплавляют в водяной бане (сняв предварительно колпачки).

Стерилизацию питательных сред в зависимости от тех ингредиентов, которые входят в их состав, осуществляют следующими способами:

• синтетические среды и все агаровые среды, не содержащие нативный белок и углеводы, стерилизуют в течение 15 – 20 мин в автоклаве при температуре 115 – 120 °С;

• среды с углеводами и молоком (в состав которых входит лактоза), питательный желатин стерилизуют текучим паром при температуре 100 °С дробно или в автоклаве при температуре 112 °С;

• среды, в состав которых входят белковые вещества (сыворотка крови) обеспложивают тиндализацией или фильтрованием;

• для стерилизации питательных сред, содержащих нативные белки, пользуются фильтрацией через мембранные фильтры.

Контроль и хранение питательных сред

Определение активной кислотности (рН).

Электрометрическое определение проводят на потенциометре или рН-метре по прилагаемым к ним инструкциям.

Определение активной кислотности с помощью индикаторной бумаги проводится по прилагаемой к ней инструкции,

Контроль на стерильность.

Среды проверяют на стерильность путем выдержки при температуре 37±1 °С в течение 1 – 3-х суток. Если после этого на пробных питательных средах не обнаруживается колоний микроорганизмов, а в жидких средах нет помутнения среды или осадка, свидетельствующих о росте микроорганизмов, питательные среды считаются стерильными,

Сроки и условия хранения питательных сред.

При отсутствии специально установленных условий и сроков хранения плотные питательные среды хранят не более месяца при температуре 20±1°С и не более 2-х месяцев – при температуре 6 °С. Жидкие питательные среды хранят не более 14 дней при 6 °С.

Методика приготовления и рецептуры питательных сред

Жидкие мясные питательные среды. Наиболее распространенными простыми питательными средами являются мясная вода, мясопептонный бульон (МПБ), пептонная вода. Эти среды служат основой для приготовления плотных мясных сред и ряда специальных сред.

Мясная вода служит основой для приготовления МПБ, МПА, МПЖ. Ее приготовляют следующим образом. Мясо освобождают от костей, сухожилий, связок и жира, измельчают на мясорубке в фарш, который заливают двойным количеством дистиллированной воды, варят в течение 1 – 1,5 ч или настаивают на холоде в течение 1 сут. Затем фильтруют через ватно-марлевый и бумажный фильтры, количество фильтрата доводят водой до первоначального объема, разливают в колбы и стерилизуют в течение 20 – 30 мин при давлении 0,1 МПа.

Пептонную воду готовят следующим образом. К 1 л водопроводной воды добавляют 10 г (1%) пептона и 5 г (0,5 %) химически чистой поваренной соли. Подщелачивают среду 10 %-ным едким натром для установления слабощелочной реакции (рН 7,4 – 7,5), кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют в течение 15 – 20 мин при давлении 0,1 МПа. Для приготовления мясопептонного бульона к мясной воде добавляют 1 % пептона и 0,5 % химически чистой поваренной соли. Затем подщелачивают среду 10 %-ным едким натром для установления слабощелочной реакции (рН 7,4 – 7,5), кипятят, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и стерилизуют в течение 15 – 20 мин при 0,1 МПа.

Плотные мясные питательные среды. Мясопептонный агар (МПА) готовят из МПБ, добавляя к нему 2 – 3 % агара. Стерилизуют так же, как МПБ.

Мясопепептонный желатин (МПЖ) готовят добавлением к мясопепонному бульону пищевого желатина – 10 – 12 % (зимой) или 18 – 20 % (летом). Температура плавления желатина около 25 – 27 °С, застывает он при температуре 18 – 20 °С, образуя плотный гель. После добавления желатина устанавливают слабощелочную реакцию среды, затем ее осветляют (добавляя яичный порошок и нагревая), фильтруют и стерилизуют (дробно – трехкратно).

К жидким молочным питательным средам относятся цельное, обезжиренное и гидролизованное молоко. Цельное молоко (кислотность 16 – 18 °Т) стерилизуют в течение 10 мин при давлении 0,1 МПа. Его используют для изучения физиологических свойств микроорганизмов (свертывание молока, характер сгустка, кислотность), количественного учета маслянокислых бактерий и приготовления заквасок.

Обезжиренное стерильное молоко разливают по 100 см³ в колбы или по 10 см³ в пробирки, стерилизуют при 121 °С 10 мин. Его используют для изучения физиологических свойств микроорганизмов, группового количественного учета молочнокислых бактерий, выращивания штаммов молочнокислых бактерий, приготовления молочного агара и как сырье для получения гидролизованного молока.

К плотным молочным питательным средам относятся агар с гидролизованным молоком, агар с гидролизованным молоком и мелом и молочный агар

Агар с молоком и мелом представляет собой молоко (основа), к которому добавляют 1,5 – 2 % агара, 2 – 3 % мела в виде тонкого порошка, нагревают до полного его растворения, фильтруют через вату, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин при Давлении 0,1 МПа. Его используют для количественного учета молочнокислых бактерий в молоке и молочных продуктах.

Натуральные среды – картофельная среда, готовится путем отвара картофеля (200 г картофеля на 1 л воды)

Синтетические среды – среда Чапека для культивирования грибов: глюкоза – 30 г., азотнокислий натрий – 2 г., фосфорнокислый (однозамещенный) калий – 1 г., сернокислый магний – 0, 5 г., хлористый калий – 0,5 г., сернокислое железо – 0,01 г, вода – 1000 мл.

Методы и средства стерилизации питательных сред

Стерилизацией (от греч. sterilis - бесплодный) называют полное уничтожение микроорганизмов в питательных средах, на посуде и других объектах, т. е. уничтожение всего живого, способного размножаться.

Стерилизация должна обеспечивать уничтожение всей микрофлоры (патогенной и непатогенной) на данном объекте. Важное значение стерилизация имеет в бактериологической практике. Полное обеспложивание питательных сред, бактериологической посуды - необходимое условие для получения чистых культур микроорганизмов. Многие лекарственные и биологические препараты (вакцины, сыворотки, аллергены) используются в стерильном виде. Широкое применение стерилизация нашла и в пищевой промышленности, особенно в консервной.

Стерилизацию проводят различными методами (табл. 1).

Таблица 1 – Методы стерилизации

Термические			Холодные
Влажная стерилизация		Сухая стерилизация	1. Фильтрование через бактериальные фильтры
1. Кипячение		1. Фламбирование	2. Ионизирующие лучи
2. Паром под давлением (автоклавирование)		2. Сухим жаром (в печи Пастера)	3. Ультразвук
3. Дробная стерилизация			4. Ультрафиолетовые лучи
Текучим паром (в автоклаве Коха)	Тиндализация (на водяной бане)		5. Инфракрасные лучи
			6. Химические

Стерилизация кипячением. Стерилизовать кипячением можно металлические инструменты, шприцы, иглы в течение 30 – 40 мин. Кипячение убивает вегетативные формы бактерий и споры некоторых бацилл (напр., Вас. cereus).

Однако даже весьма продолжительное кипячение не обеспечивает гибели спор ряда анаэробных бацилл: Cl. botulinum, Cl. sporogenes, Cl. perfringens, выдерживающих кипячение более 1-3 час.

Стерилизация паром под давлением (автоклавирование) – самый эффективный в бактериологической практике способ стерилизации, так как с его помощью быстро достигается полное и надежное обеспложивание, ведущие к гибели не только вегетативных, но и споровых форм наиболее устойчивых бацилл. Губительное действие высокой температуры обусловливается повреждением коллоидного состояния плазмы, денатурацией белка с последующей коагуляцией его, а также нарушением ферментных систем микроорганизмов. Этот способ стеризации основан на том, что образующийся при кипячении воды пар не выходит наружу, а, скапливаясь в замкнутом пространстве, повышает давление. Горячий водяной пар быстро проникает в живые клетки микробов и вызывает их гибель. Действие горячего пара будет эффективнее при увеличении давления, так как при этом повышается температура пара.

Стерилизация насыщенным паром под давлением проводится, в автоклавах (рис. 14). Автоклав представляет собой массивный металлический двухстенный котел с герметически закрывающейся крышкой. Между внутренней и наружной стенками котла на дно наливается вода через трубку с плотно закрывающимся краном. Уровень налитой в автоклаве воды определяется по водомерному стеклу - стеклянной трубке, соединенной с пространством, в которое налита вода. В нижней части автоклава имеются краны для сливания воды после стерилизации и выпуска воздуха и пара.

Рисунок 14 – Автоклав вертикальный (схема):

1 -стерилизационная камера;

2 - кран для выхода воздуха;

3 -манометр; 4 - предохранительный клапан; 5 - водопаровая камера; 6 - воронка для заполнения автоклава водой; 7 - отверстия для поступления пара в стерилизационную камеру;

8 – крышка автоклава; 9 - подставка для размещения стерилизуемых материалов.

Автоклав подогревается электронагревательным прибором. Образующийся при кипении пар проходит между стенками автоклава и через отверстия в верхней части внутренней стенки попадает во внутреннее пространство автоклава, куда помещаются стерилизуемые предметы, и вытесняет воздух. При постоянном подогревании воды непрерывно образующийся пар повышает давление внутри котла выше атмосферного, что повышает температуру кипения воды. За повышением давления следят по показаниям манометра, соединенного с внутренним пространством автоклава (манометр показывает избыточное, выше атмосферного, давление).

Обычно стерилизацию проводят при 0,1 МПа, обусловливающей температуру 121°С, в течение 20 – 30 мин., при этом погибают вегетативные и споровые формы микробов. Современные автоклавы имеют вертикальное или горизонтальное расположение камеры для стерилизации. Манометр обязательно два раза в год должен проверяться специальной организацией - котлонадзором. Показания манометра соответствуют следующей температуре пара в автоклаве: 0,05МПа (0,5 кгс/см²) – 112 °С; 0,07 МПа (0,7 кгс/см²) – 115,5 °С; 0,1 МПа (1 кгс/см²) – 121 °С; 0,15 МПа (1,5 кгс/см²) –127 °С; 0,2 МПа (2 кгс/см² ) –-134 °С.

Во избежание разрыва автоклава от высокого давления автоклав снабжают предохранительным клапаном, который регулируется на определенное давление и автоматически открывается, выбрасывая излишки пара наружу (в атмосферу), при повышении давления внутри автоклава выше того, на которое он отрегулирован.

В автоклаве можно стерилизовать посуду, инструменты, питательные среды (кроме сывороточных, белковых и углеводных сред), перевязочный материал, культуры микроорганизмов, трупы лабораторных животных и т. д.

Стерилизацию паром под давлением проводят в электрических автоклавах.

При работе с автоклавом необходимо соблюдать определенную последовательность и технические правила, обеспечивающие эффективность и безопасность работы с ним.

Стерилизация текучим паром в аппарате Коха. Текучим паром стерилизуют питательные среды, содержащие вещества, разрушающиеся при стерилизации в автоклаве при 121 °С (желатин, молоко, углеводные среды).

Стерилизацию текучим паром проводят в течение трех дней подряд по 30 – 60 мин. ежедневно. В промежутках стерилизуемый объект выдерживают при комнатной температуре.

В основу метода дробной стерилизации положен следующий принцип: при нагревании до 100 °С в течение 30-60 мин. погибают все вегетативные формы микроорганизмов, но споры остаются и в промежутке между стерилизацией прорастают в вегетативную форму. Через сутки снова стерилизуют. Обычно после третьей стерилизации достигается полное обеспложивание объекта.

Стерилизацию текучим паром проводят в аппарате Коха или в автоклаве. Крышку автоклава не привинчивают, кран пароотводной трубки оставляют открытым, пар свободно выделяется наружу.

Тиндализация – представляет собой дробную стерилизацию при низкой температуре, предложенную Тиндалем для объектов, не переносящих температуры 100 °С (среды с кровяной сывороткой, яичным белком). Их подвергают нагреванию в течение 5 – 6 дней подряд при температуре 56-58 °С по 1 часу ежедневно (в первый день – в течение 2-х часов). В промежутках между прогреванием стерилизуемая жидкость хранится в термостате. При этом оставшиеся в живых споры прорастают в вегетативные клетки, которые погибают при последующем нагревании. Тиндализацию проводят в специальных приборах с терморегулятором или на водяных банях.

Сухая стерилизация

Прокаливание (фламбирование). Прокаливать можно непосредственно перед употреблением бактериологические петли, иглы, шпатели, мелкие металлические предметы (ножницы, пинцеты и т. д.), предметные стекла, стеклянные палочки и прочее.

Стерилизация сухим жаром (сухим нагретым воздухом) производится в особых аппаратах - печах Пастера или сушильных шкафах. Стерилизуют сухим жаром стеклянную посуду, пипетки, чашки Петри.

Посуду перед стерилизацией высушивают и заворачивают в бумагу, пробирки и колбы закрывают ватными пробками. Это делается для того, чтобы после стерилизации их не обсеменять (не загрязнять) микробами из воздуха. Режим стерилизации сухим жаром при температуре + 150 °С – в течение 2-х часов; при температуре плюс 160-170 °С – в течение 1 – 1,5 часов. При температуре плюс 160 – 170 °С бумага желтеет, что является показателем правильно проведенной стерилизации.

По окончании стерилизации печь открывают только после того, как она остынет до 50 – 70 °С (в противном случае вследствие резкой разницы температур стеклянные предметы могут лопнуть).

Методы холодной стерилизации

Стерилизация фильтрованием. Применяется для стерилизации жидкостей в тех случаях, когда их нельзя подвергнуть нагреванию (сыворотка крови, кровь, ряд лекарственных веществ). Проводится путем фильтрации жидкостей через специальные фильтровальные приборы. Фильтровальные приборы имеют настолько мелкие поры, что на своей поверхности задерживают все механические, взвешенные в жидкости частицы, в том числе и микроорганизмы.

Ионизирующие излучения. Коротковолновые излучения, обладающие энергией, способной выбить электрон из атома, называются ионизирующими. К ионизирующим лучам относятся X и -лучи. Ионизирующие лучи в больших дозах (1000 Дж/кг) вызывают в 90-97% случаях гибель бактерий, а дозы 7-10 тыс. Дж/кг приводит к полному отмиранию микробов. Ядерные излучения применяют для стерилизации лечебных препаратов и пищевых продуктов.

Стерилизация с помощью ультразвуковых волн. Ультразвук -это механические колебания с частотами выше 20000 колебаний в секунду. Ультразвуки способны распространяться в твердой, жидкой и газообразной средах. Под влиянием определенной интенсивности ультразвуковых волн инактивируются ферменты, токсины, вирусы. Бактериальная клетка погибает под влиянием ультразвука в связи с разрывом оболочки. Ультразвук может применяться для стерилизации воды, молока и различных продуктов. Летальное действие УЗ-волн на бактерии и вирусы начинает проявляться при озвучивании среды с частотой колебаний около 100 000 герц.

Для уничтожения микроорганизмов используют инфракрасные и ультрафиолетовые лучи, химические вещества (дезинфекция).

Инфракрасные лучи. Эти излучения нагревают стерилизуемый объект быстро и по всей толщине, в отличие от нагревания паром, когда прогревание идет с поверхности внутрь. Скорость отмирания микробов зависит от температуры нагревания. Тепло, получаемое от инфракрасных лучей, может использоваться для обезвоживания, варки, копчения, вытапливания жира, размораживания, бланшировки.

Ультрафиолетовые лучи применяют для стерилизации воздуха в холодильниках и цехах предприятий, используют для стерилизации воды и напитков, рассолов, поверхностей сыров, для облучения молока с целью обогащения его витаминами группы «Д».

Химические методы стерилизации (консервирование) имеют ограниченное применение. В лабораторной практике консервируют питательные среды хлороформом, толуолом, иногда эфиром. Для освобождения от консерванта питательные среды нагревают на водяной бане при 56 °С.

Вакцины и лечебные сыворотки консервируют 0,25 – 0,5 %-м раствором фенола, 0,5%-ми растворами хлороформа или формалина, раствором мертиолата в конечном разведении 1:5000 – 1:10000. Для консервирования диагностических (агглютинирующих) сывороток используют борную кислоту, толуол, глицерин.

Подготовка посуды для стерилизации.

Лабораторная посуда должна быть чисто вымытой. Для мытья используют суспензию мыла или химические моющие средства. Вымытую посуду не вытирают, а высушивают в сушильном шкафу. Чистую посуду перед стерилизацией заворачивают в бумагу.

Бактериологические пробирки и колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, изготовленными из гигроскопической ваты. Длина пробки не более 3 см, она должна свободно входить в пробирку на 1,5 – 2 см, быть достаточно плотной, сохранять свою форму при многократном открывании и закрывании пробирки. Для изготовления пробки вручную берут вату и закручивают её крепко валиком. Слишком плотные пробки затрудняют снабжение культур воздухом. Ватные пробки необходимо обшивать марлей.

Посуду для бульона и плотных агаровых питательных сред стерилизуют в автоклаве вместе со средой и ватными пробками. Посуду для желатина и сред с углеводами предварительно стерилизуют в сушильном шкафу в течение 1 – -2 ч, при 165 – 170 °С.

При стерилизации сред текучим паром, тиндализацией или под давлением не более 0,05 МПа необходимо использовать стерильную посуду. Чистые чашки Петри в собранном виде перед стерилизацией заворачивают в бумагу по 3 – 4 штуки. После стерилизации бумага предохраняет стерильную посуду от загрязнения микрофлорой. Пипетки также стерилизуют в завернутом виде.

В более толстые концы мерных и пастеровских пипеток вставляют ватные тампоны. Мерные пипетки заворачивают в длинные полоски бумаги шириной 4 –5 см. Обмотку начинают с носика (капилляра) и движением полоски бумаги по спирали заканчивают у противоположного конца пипетки.

Пастеризация. – термическая обработка жидких и полужидких продуктов при температуре ниже 100 °С с последующим быстрым охлаждением до температуры 6 – 9 °С. При пастеризации погибают неспоровые микроорганизмы и снижается общая бактериальная загрязненность продукта, повышается его стойкость. Охлаждение, следующее за нагреванием, предотвращает развитие микроорганизмов, не убитых термической обработкой. Пастеризацию применяют для обеззараживания молока, вин, икры, фруктовых соков и других продуктов.

Существует три режима пастеризации: длительная - при температуре 65 °С в течение 30 мин.; кратковременная (быстрая) – при 75 °С, экспозиция от нескольких секунд до 5 мин.; молниеносная – при 90 – 93 °С без выдержки.