5. Свойства красителей, принципы окрашивания.

Красители классифицируются по происхождению и химическим свойствам. По химическим свойствам они делятся на кислые и основные красители.

К группе кислых красителей относятся кислый фуксин, пикрофуксин, пикриновая кислота и эозин. Чаще всего мы будем изучать срезы, обработанные эозином, который окрашивает протоплазму, оболочку клеток, межклеточное вещество соединительной ткани в розовый цвет. По происхождению эозин исскуственный краситель. Микроскопические структуры окрашиваемые эозином и подобным ему структурами, называются эозиноофильными или оксифильными или ацидофильными. Способность воспринимать эти красители называется эозинофилией или оксифилией или ацидофилией.

К группе основных красителей относятся: кармин, сафранин, метиловый синий, азур, гематоксилин, который по способу приготовления краски бывает гематоксилин Майера, Бемера, Вейгерта, железным гематоксилином Гейденгайна. Красящие свойствами обладают не сам гематоксилин, а продукт его окисления. Гематоксилин это краситель растительного происхождения. Гематоксилин окрашивает структуры в синий или фиолетовый цвет. Очень ярко гематоксилин окрашивает ядра клеток. Структуры, окрашиваемые основными красителями будут называться базофильными. Свойство воспринимать эти красители называется базофилией. Изучаемые нами препараты чаще всего будут окрашены гематоксилином. Кармин, также ядерный краситель, но животного происхождения, вырабатывается из насекомых кошенили, живущих на кактусовых деревьях. Большинство же красителей получены синтетическим путем (искусственные краски).

Чаще всего на занятиях будут использоваться препараты, окрашенные гематоксилином и эозином. Это самая распространенная гистологическая обзорная окраска.

Существуют красители со специальными свойствами, позволяющие выявлять разные вещества и структуры клеток.

Судан-3 окрашивает жировые включения в оранжевый цвет. Осмиевая кислота окрашивает жир в черный цвет. Импрегнация азотнокислым серебром нервной ткани позволяет выявить ее компоненты, окрашиваемые черным цветом. Гликоген выявляется кармином Беста. Такие красители называются гистохимическими.

Знакомство с этапами приготовления гистологического препарата

Процесс обработки материала для изготовления гистологических препаратов слагается из следующих этапов:

1. Взятие материала. Из органа вырезается кусочек, размеры которого не должны превышать 1-куб.см.

2. Фиксация материала. Фиксация проводиться для того, чтобы остановить в тканях протекающие жизненные процессы и предупредить последующий их распад. Фиксирующие жидкости: 10-12% водный раствор формалина, разные спирты, сложные красители-фиксаторы Карнуа, Буэна и т.д.

3. Обезвоживание, обезжиривание и уплотнение материала. Этот процесс осуществляется в спиртах возрастающей крепости и в растворах спирта с эфиром в следующей последовательности: Зафиксированный кусочек материала проводят через батарею спиртов:50, 70, 96 градусов (две порции), абсолютный спирт, абс. спирт +эфир ( две порции). В каждом отмеченном растворе кусочек находиться не менее суток.

4.Заливка материала. Заливка производиться в парафин, целлоидин или желатину. Заливка материала проводиться для того, чтобы предать ему такую консистенцию, чтобы этот материал можно было резать на очень тонкие пластинки- гистологические срезы. Залитый материал может долго храниться. Чаще всего заливают в парафин. Вначале материал пропитывают жидким парафином в термостатах при высокой температуре, а затем на воздухе при комнатной температуре заливают в парафин, который застывает и становиться твердым. Залитый материал называют гистологическим блоком.

5. Приготовление гистологических срезов. Залитый в парафин кусочек материала приклеивают на деревянную основу, укрепляют на предметном столике микротома. Микротом это прибор, оснащенный микротомным ножом, с помощью которого можно изготавливать очень тонкие гистологические срезы толщиной 3-5 микрометров.

6. Окраска гистологических срезов. Различные тканевые элементы избирательно относятся к красителям, что позволяет их дифференцированно окрасить. Ядра клеток окрашиваются основными красителями- гематоксилином, азуром, кармином и др.. Цитоплазма красится кислыми красителями- эозином, фуксином и др.

7. Обезвоживание и просветление окрашенных срезов и заливка их в бальзам. Окрашенные срезы обезвоживают в 2-х порциях 96 градусного спирта, просветляют в карбол-ксилоле, переносят посредством шпателя на предметное стекло, наносят на срез каплю бальзама и накрывают покровным стеклом. Препарат готов для исследования и может храниться долгое время. Каждый студент должен приготовить 2 препарата: один- из растительной, другой из животной ткани.

РЕЦЕПТ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ОКРАСКИ СРЕЗОВ

А. Из животных тканей

0. Спирт 2-мин.

1. Гематоксилин 2-мин.

2. Вода водопроводная 2-мин.

3. Эозин 1-мин.

4. Вода дистиллированная 2 -мин.

5. Спирт 96 % 1-мин.

6. Спирт 96% 2- мин.

7. Карбол-ксилол 2-мин.

8. заключить срез в бальзам.

Б.Из растительной тканей.

1. Взятие материала ( вырезать пленку лука)

2. Фиксация лука в 96% спирте 2-мин.

3. Гематоксилин 2 мин.

4. Вода водопроводная 1 мин.

5. Спирт 96 % 2 мин.

6. Спирт 96 % 1 мин.

7 Карбол-ксилол 3 мин.

8. Заключить срез в бальзам.

Ознакомиться с демонстрацией гистологических препаратов:

1.Растительные клетки кожицы лука.

Окраска: гематоксилин и эозин.

2.Щитовидная железа.

Окраска: гематоксилин и эозин.

ПРАВИЛА РАБОТЫ С МИКРОСКОПОМ.

1. Установить микроскоп у края стола против левого плеча. С правой стороны расположить открытую тетрадь для практических занятий. Протереть окуляр марлевой салфеткой. Обратить зеркало микроскопа вогнутой стороной к источнику света.

2. Привести микроскоп в рабочее состояние:

а) установить объектив малого увеличения на расстоянии 1-1,5 см от предметного столика;

б) поднять конденсор до предела;

в) смотря в окуляр одним глазом, не закрывая другого, равномерно и интенсивно осветить зеркалом поле зрения.

3. Поместить препарат на предметны1й столик микроскопа покровным стеклом кверху (обратить на это внимание). Передвигать препарат большим и указательным пальцами за ребро с тем, чтобы найти место, подлежащее к изучению; средний палец должен упираться в предметный столик.

4. Опустить конденсор до положения, обеспечивающего наилучшее освещение препарата на “малом” увеличении.

5. Рассмотреть препарат с помощью 8- или 10-кратного объектива, который чаще будет называться “малым увеличением”. Найти место, подходящее для изучения при большом увеличении, поставить его в центр поля зрения. Отрегулировать резкость микровинтом.

6. При переходе с малого увеличения на большое необходимо не меняя фокусного расстояния повернуть револьверную головку объективов так, чтобы в рабочее положение встал 40-кратный объектив, который чаще будет называться “большим увеличением”. Микровинтом добиться резкого изображения. Работа с макровинтом на большом увеличении запрещается, т.к. легко можно раздавить препарат.

7. Левая рука должна находится на микрометрическом винте, слегка поворачивая его в обе стороны для просматривания деталей среза лежащих на разной глубине поверхности среза.

8. Уяснив пространственное положение, пропорции и взаимоотношения деталей изучаемого объекта приступить к зарисовке.

9. Запрещается убирать препарат из под объектива большого увеличения. Для того, чтобы убрать препарат с предметного столика микроскопа в рабочее положение ставится малый объектив и препарат снимается со столика микроскопа.

10. Запрещается развинчивать какие-либо части микроскопа. В случае неисправности микроскопа обращаться к преподавателю.