Лабораторна робота №2

(4 годин)

Тема: Кількісне визначення амінокислот методом розподільної хроматографії на папері

Мета роботи: Вивчити хроматографічний метод кількісного визначення амінокислот з використанням розподільної хроматографії на папері.

Теоретичні відомості

Для хроматографічного розподілу амінокислот в суміші та їх кількісного визначення застосовується метод розподільної хроматографії на папері, запропонований у 1944 р. Мартіном і Сінджем, який базується на розподілі речовин рухомої фази відносно нерухомого носія в залежності від їх спорідненості з носієм. Амінокислоти можуть бути розподілені між двома рідкими фазами, що не змішуються, в таких системах як фенол-вода або н-бутанол-вода. Розчинені амінокислоти розподіляються між рівними обємами двох рідин. Відношення концентрацій амінокислоти у рідких фазах, що знаходяться у стані рівноваги при даній температурі називається коефіцієнтом розподілу. Кожна амінокислота має характерний тільки для неї коефіцієнт розподілу, що відповідає даній парі розчинників.

Суміш амінокислот з різними коефіцієнтами розподілу можна кількісно розділити хроматографією на папері між двома рідкими фазами, що не змішуються. Процес розподілу багаторазово повторюється під час руху суміші, що розділяється, вздовж тонкого шару паперу. Якщо одна речовина з низьким коефіцієнтом розподілу Z рухається по хроматографічному папері швидше ніж речовина Y, що має більш високий коефіцієнт розподілу, то через деякий час ці речовини повністю розділяться, При цьому спостерігається тенденція до концентрації кожної речовини в певному місці у вигляді плями.

В якості носія нерухомої фази використовується чиста целюлоза у вигляді спеціального фільтрувального паперу, який повинен бути особливо чистим та мати дуже рівномірно розподілену щільність. Целюлоза, з якої складаються волокна фільтрувальної бумаги, що застосовується в хроматографії, знаходяться в гідратованому стані. По мірі того як розчинник, що містить суміш амінокислот, піднімається під дією капілярних сил по бумазі, закріпленій вертикально, проходить безліч мікроскопічних актів розприділення амінокислот між рухомою фазою та стаціонарною фазою, повязаною з волокнами бумаги. В кінці цього процесу різні амінокислоти проявляються на різній відстані від старту.

Хроматографічне розділення суміші амінокислот на папері можна проводити послідовно в двох напрямках на квадратному листку хроматографувального паперу з використанням двох різних систем розчинників. В такому випадку одержуємо двовимірну карту розташування різних амінокислот.

Існує кілька різновидів хроматографічного паперу, який відрізняється товщиною та щільністю:

• папір № 1 та 2 менш щільний і називається "швидким";

• папір № 3 і 4 — "повільним".

Звичайні сорти паперу гідрофільні і містять до 20-22 % вологи. Тому при використанні води як нерухомої фази спеціального зволоження паперу не потрібно.

Метод розподільної хроматографії на папері застосовуєтся для кількісного визначення амінокислот після їх хроматографічного розділення.

Основа методу — реакція амінокислоти з нінгідрином у слабокислому середовищі з подальшим перетворенням отриманого в результаті реакції нестійкого синьо-фіолетового похідного — дикетогідринделідендикетогідрин-диамін (ДІДА) в стабільне похідне міді оранже­во-червоного кольору, яке має максимум поглинання при 530 нм. Кількісне визначення амінокислот базується на вимірюванні оптичної густини Cu-похідного ДІДА після його вимивання з паперу. Лінійна залежність між вмістом амінокислот у плямі та оптичною густиною забарвлення залишається між 0,025 та 0,25 мкмоль амінокислоти.

Метод застосовується для визначення всіх амінокислот, за ви­нятком проліну і оксипроліну, які інакше реагують з нінгідрином і утворюють мідне похідне іншої будови.