Лабораторна робота №1 Тема: Отримання чистих культур мікроорганізмів Мета роботи: набуття досвіду по виділенню чистої культури мікроорганізмів.

Теоретичні відомості.

У біотехнологічних виробництвах в якості одного з видів вихідних матеріалів використовують чисту культуру мікроорганізмів. Чистої культурою (ЧК) називають популяцію, яка була потомство однієї або декількох клітин одного виду мікроорганізмів. У генетичних дослідженнях користуються клонами - чистими культурами, отриманими від однієї суперечки або гаплоидной клітини.

У природних умовах різні об'єкти містять, як правило, змішану мікрофлору. Для діагностичних досліджень з метою з'ясування збудників псування харчових продуктів або їх обсіменіння мікроорганізмами потрібно виділення чистої культури.

Методи виділення ЧК можуть бути прямими і кіс веннимі. Прямі - засновані на виділенні під безпосереднім контролем через мікроскоп, наприклад метод Лінднера.

Відомі методи вилучення однієї клітини з суспензії мікроорганізмів за допомогою спеціальних приладів (мікроманіпулятор, мікроселектор Перфільева) під контролем мікроскопа. Однак найбільш поширеним способом виділення чистих культур є непрямі методи виділення чистої культури мікроорганізмів, засновані на ізоляції однієї мікробної клітини від маси мікроорганізмів і подальшому вирощуванні потомства цієї клітини на поживних середовищах ізольовано від інших видів.

Для посіву частіше використовуються щільних середовищах в чашках Петрі. Цей метод запропонований відомим німецьким мікробіологом Кохом і носить назву методу пластинчастих (або чашкових) культур Коха.

Основним завданням методу є розведення концентрації мікроорганізмів в досліджуваному матеріалі з таким розрахунком, щоб при посіві його на живильному середовищі виросли ізольовані колонії. Існують два основні методи розведення досліджуваного матеріалу:

1) на поверхні щільного поживного середовища «методом виснажує посіву»;

 2) попереднє розведення матеріалу в фізіологічному розчині або стерильної водопровідної кладі в пробірках і висів готового розведення на щільну живильне середовище.

Метод виснажує посіву на поверхні щільного середовища використовується для виділення чистих культур аеробних і факультативно анаеробних мікроорганізмів. З цією метою для посіву беруть ряд чашок Петрі з щільним середовищем; в першу чашку наносять досліджуваний матеріал і розподіляють його по поверхні шпателем Дрігальского або бактеріологічною петлею. Потім, не стерилізуючи шпатель (або петлю), проводять посів послідовно на поверхню середовища в інших чашках (рис. 1). Кількість матеріалу, внесеного в середу, при цьому послідовно убуває (виснажують посів). Метод попереднього розведення досліджуваного матеріалу в стерильній водопровідній воді (або фізіологічному розчині) використовується для виділення чистих культур мікроорганізмів, як аеробних, так і анаеробних.

Готують розведення матеріалу в 10 - 100 разів і більше (в залежності від передбачуваної обсіменіння мікроорганізмами) і проводять посів розведень, користуючись поверхневим або глибинним методом (рис. 2). Виділення чистих культур строгих анаеробів за методом Коха вимагає умов вирощування без доступу кисню. Якщо розведення досліджуваного матеріалу виконано правильно, на поверхні середовища або в її товщі (в залежності від методу посіву) утворюються ізольовані колонії мікроорганізмів, видимі неозброєним оком. Кожна колонія складається з клітин одного виду, однак для виділення чистої культури необхідно пере сіяти колонію на окрему середу, тобто ізолювати її від мікроорганізмів інших видів.

Мал. 1. Посів мікроорганізмів на поверхню щільного середовища в чашках Петрі: а - шпатель Дрігальского; б - положення чашки і руки при посіві шпателем; в - зростання мікроорганізмів після розсівання шпателем; г - зростання мікроорганізмів після розсівання петлею

Завершальним етапом виділення чистої культури мікроорганізмів невідомого виду є перевірка її чистоти на ізольованому середовищі візуально (перегляд посіву неозброєним оком) і мікроскопією мазка. Видова назва чистих культур більшості мікроорганізмів встановлюють шляхом вивчення морфологічні, культуральних і фізіологічних властивостей.

Для ідентифікації цвілевих грибів досить вивчити морфологічні та культуральні властивості. За сукупністю вивчених ознак визначають таксономічне положення (положення в систематики) мікроорганізмів, користуючись спеціальними визначниками. Морфологічні властивості досліджують при мікроскопії прижиттєвих або фіксованих забарвлених препаратів. Морфологічна характеристика мікроорганізму повинна включати форму клітин, їх поєднання і розміри, рухливість, здатність до утворення спор, наявність включень. При описі морфології слід вказувати вік культури, склад середовища, умови культивування.

Культуральні властивості мікроорганізмів встановлюють за особливостями росту на поживних середовищах. На рідких поживних середовищах відзначають характер розподілу культури - рівномірний, що викликає помутніння середовища, придонне або поверхневе, що обумовлено ставленням мікроорганізмів до кисню повітря. Каламутність середовища може бути пластівчасту, однорідною. Плівка - тонкої, щільною і пухкої, гладкою, зморшкуватою або складчастої. Осад - мізерним або рясним (кількість); щільним, пухким, слизових (консистенція).

На щільних поживних середовищах досліджують характер колоній. Оскільки колонія утворюється в результаті розмноження однієї клітини, то її будова залежить від особливостей поділу клітин даного виду мікроорга низмов. Найбільш типово видові ознаки виражені у поверхневих колоній:

• форму, профіль, блиск і колір відзначають візуально;

• край і структуру - при малому збільшенні мікроскопа;

• консистенцію (м'яка, слизова, тягуча або тендітна) визначають дотиком до її поверхні петлею;

• розміри - звичайною лінійкою або окулярним мікрометрів при малому збільшенні мікроскопа (коло ванні точкові - менше 1 мм в діаметрі, дрібні - 1-2, великі - більше 4 мм). Фізіологічні властивості мікроорганізмів обумовлені ферментативної активністю і, отже, висловлюють особливості обміну речовин клітини.

Це важливий диференційний ознака, який використовується при ідентифікації бактеріальних і дріжджових видів. Поширеним методом вивчення фізіологічних властивостей мікроорганізмів є вирощування їх на диференційно діагностичних середовищах, що дозволяють визначити біохімічну активність мікроорганізмів щодо речовин, введених в середу.

Ставлення до кисню (тип дихання) визначається за характером росту в стовпчику агару (МПА) при посіві уколом.

Після інкубації в термостаті протягом 48 годин при температурі 30 - 38° С можливі три типи росту в залежності від типу дихання:

• зростання капелюшком на поверхні (аеробні мікроорганізми);

• зростання у дна пробірки (анаеробні мікроорганізми);

• зростання, рівномірний по всій довжині уколу (факультативно анаеробні мікроорганізми).

 Протеолітичні властивості визначають по виділенню з живильного середовища газів - продуктів розщеплення білка; для цієї мети культуру вирощують на МПБ або м'ясний воді, закріпивши в пробірці смужку фільтрувального папірця, просочену реактивом, що реагує на наявність певного газу. Так, виділення аміаку виявляють по синього кольору лакмусового папірця, сірководню - за допомогою фільтрувального паперу, просоченої оцтовокислим свинцем (папір чорніє в результаті утворення сірчистого свинцю), індолу - за допомогою папірці, просоченої щавлевої кислотою (почервоніння в результаті утворення зі єднання з індолом) .

Про протеолітичних властивості мікробів судять також по здатності розріджувати желатин. При посіві уколом в стовпчик желатину через 2 години культивування відзначають наявність і характер розрідження - пошарове, воронкообразное, пухирчасті.

Сахаролитические властивості визначають на МПБ, 1% ном розчині пептонною води і ін., Що містять той чи інший вуглевод і індикатор. Розщеплення вуглеводів під впливом мікробів супроводжується зміною кольору індикатора в результаті підкислення середовища, а на рідких середовищах в ряді випадків і газоутворенням, яке вловлюють за допомогою скляного «поплавка». Утворився газ витісняє середу і виявляється в поплавці у вигляді бульбашки.

Характер згортання лакмусового молока є важливим біохімічним ознакою. При посіві на лакмусовое молоко відзначають зміни рН і характер згустку. Залежно від того, на яку складову частину молока діють ферменти досліджуваного мікроорганізму, розрізняють наступні зміни в молоці:

а) кислотне згортання - дія ферменту на лактозу - супроводжується утворенням щільного згустку і підвищенням кислотності; колір молока змінюється від бузкового до червоного;

б) пептонізація - дія протеолітичних ферментів на білки молока - супроводжується утворенням каламутній жовтуватою рідини, середовище стає лужний через виділення аміаку і молоко синіє.

Про здатність рости на картоплі виявляють при посіві мікроорганізмів на скошений стерильний скибочку картоплі. При цьому відзначають додатковий культуральний ознака, а також амілолітичну здатність культури по пробі з йодом. Посиніння середовища після нанесення краплі розчину Люголя в зоні росту мікроорганізмів вказує на наявність у них ферменту амілази. Слід підкреслити, що перелік досліджуваних ознак, як і методи культивування, диференціюється в залежності від передбачуваного виду мікроорганізмів.