1.1. Биобалистика әдісі жағдайында трансформация жүргізу түсінігі

Биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі өсімдік материалынан бірінші рет каллус алу өте қиын, себебі әр түрлі өсімдіктердің ұлпалары, тіпті бір өсімдіктің әр бөлігінен алынған ұлпаларының дедиференциалануы және каллусогенезі жүру үшін, әр түрлі қоректік орталарды талап етеді, әсіресе ондай талап гормондардың мөлшері мен ара қатынасына қойылады. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі, ұлпаларын кайталап отырғызып ұзак, мерзімде өсіргенде, ондай ұлпалар әжептәуір мөлшерде ауксин мен қатар цитокининді синтездеу қабілетіне ие болады, яғни бұл гормондарға байланысты автотрофтарға айналады. Бұндай каллус клеткалары "қалыптасқан",-деп аталады. Гормондарға тәуелсіз штаммдардың пайда болу себебі өлі белгісіз. Олардың шығуы мутациялардың әсерінен, немесе жаңа гендердің іске қосылуынан болуы мүмкін. Ісік клеткаларын жасанды ортада өсіргенде, оларда гормондарға тәуелсіз.

Биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі Клеткаларды қоректік ортада өсіргенде каллустық клеткаларға айналады, бірақ ондай жағдайда барлық клеткалар біркелкі болмайды. Жасанды ортада өскен клеткалардың түрлілігі/гетерогенді/ морфология, физиология және генетика түрғысынан болуы мүмкін.

Өсу процессін түрлі факторлардың қатысуымен реттеуге болады және мынадай көрсеткіштер арқылы бақылауға болады: өлшем, көлем, масса, клеткалар саны, белоктың және ДНҚ-ның мөлшері. Тәжірибенің мақсатына байланысты, келтірілген көрсеткіштердін, біреуі қолданылады. Клеткалардың өсуін зерттеп білу үшін, белок пен ДНҚ мелшерін белгілі бір әдістермен анықтаған ыңғайлы және оны клеткалар санын анықтағанда да қолдануға болады.

Өзіне тән бір қалыпты өсуімен және көбеюімен сипатталынатын ретсіз өсетін каллус клеткалары қайта дифференциялану процестері арқасында, ұлпалар (гистогенез), мүшелер (органогенез) және ұрық тәріздес құрылымдар-эмбриондар (эмбриогенез, немесе сомалық эмбриогенез) түзе алады.

Іn vitro жағдайында өсіретін клеткалар өсімдіктер биотехнологиясында екі бағытта қолданылады: біріншісі- клеткалар массасы, яғни каллус; екіншісі- регенерант өсімдіктері.

in vitro көбейтудің этаптары микрокөбейтудің барлық бастапқы

өсімдіктерді клондау арқылы процесстерін 4 кезеңге бөлуге болады:

Бірінші этап. Өсімдіктердің бастапқы ұлпаларының экспланттарын іn vіtro өсіру. Бұл кезеңде қоректік ортада инфекциядан таза ұлпаларды өсіріп, олардың тіршілігін сақтап, экспланттардың тез өсуіне қол жеткізу керек. Өсімдіктерді көбейтуде жетістікке жету, эксплантты дұрыс тандап алудан басталады, бұл кезде донорлық өсімдіктің өсу фазасы және өсу жағдайларын ескеру керек.

Екінші этап. биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі

Нактылы микрокөбейту кезеңі, яғни эксплантта бастама клеткалар /инициальдар/ санын көбейтіп, олардан өркендердің пайда болуына жағдай жасау.

Үшінші этап. биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі.Көбейтілген өркендерді тамырландыру және оларды сақтау. Бұл кезенде тамыр жүйесінің қалыпты өсуіне толык жағдай жасалады, қоректік ортаға тамыр пайда болуына жауапты фактор-ауксин косылады. Одан кейін өсімдіктерді топыраққа отырғызуға дайындау басталады немесе сақтау үшін төмен температура жағдайына ауыстырады.

Кез келген биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі тірі ұлпасын қолайлы /лайықты қоректік заттар мен гормондары бар/ ортаға отырғызса, одан маманданбаған клеткалар колониясы пайда болады, оны каллус деп атайды. биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі ортадағы клеткалардың ретсіз бөлінуінің нәтижесінде пайда болған ұлпа. Бұрыннан бар клеткалардың көбейуінен жаңадан клеткалар мен ұлпалар тузілуін пролиферация деп атайды. Сөйтіп биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі пролиферацил нәтижесінде шығады.

Жасанды қоректік орта жағдайында, яғни биобалистика әдісі арқылы өсімдік тарнсформациясын жүргізілу тиімділігі жағдайында өсімдіктердің барлық ұлпалар типтері клеткалары каллус клеткаларына айналады. Бұл процесс дифференциялану деп аталады, оның есебі фитогормондарға байланысты. Қөректік ортаның құрамын өзгерте отырып, ретсіз өсіп жатқан ұлпалардан регенерант- өсімдік алуға болады. Сонымен бір клеткадан тұтас бір өсімдікті өсіріп алуға болады, яғни өсімдік клеткалары ерекше касиетін – тотипотенттілігін көрсетеді.

Каллус биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі ұпаларының әр типті морфогенезге икемді болғандықтан оларды көптеп өсіреді. биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын түзілуі мен өсуін ауксиндер мен цитокиниңдер реттеп отырады. Көптеген жағдайда трансформация түзілуі үшін кейінгі өсуге қарағанда ауксиндерді 10 есе артық қажет етеді. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі өсу қарқындылығымен ерекшеленеді, түсі арқылы /ақ- ақшылдан -қара қоңырға дейін, тығыздығына қарай /бос- борпылдақ, тығыз, т.б. түрлері жарықта түсін өзгертіп көгеретіндігімен тағы сол секілді белгілерімен бір-бірінен ажыратылады. Өсімдік трансформациясы ұлпаларды 3-4 апта өткеннен кейін, коректік ортадан шығарып алады да, бірнеше бөлікке бөліп, басқа жаңадан дайындалған қоректік ортаға отырғызылады, себебі қоректік ортаның күші әлсірейді, ұлпаның қоректенуі және ұлпаның ішкі бөліктерінің аэрациялануы төмендейді. Жаңа қоректік ортаның құрамы эксперименттің мақсатына байланысты болады, Егер биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі бір қалыпты өсуін сақтап отыру керек болса, онда бастапқы қоректік орта құрамы өзгермейді.

Кейбір тәжірибелерде биобалистика әдісі бір-біріне тигізетін әсерін ескере отырып, каллустарды өсірудің арнайы әдістері қолданылады. Қоректік ортада өсіру әдісінің бірі " бағушы" немесе " асыраушы қабат", яғни бір биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі өсу үшін өсіру әдісінің бірі - екінші бір каллус ынталандырушы ретінде қолданылады. Бұндай жағдайда ұлпаны қоректік орта сіңген фильтр қағазына салады да, өсімдіктің сол түрінің жаксы өсіп тұрған каллус массасына отырғызады. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі ыдыстың ішінде әр түрлі өсімдіктердің ұлпаларын өсіруге болады. Кейбір жағдайларда ұлпаларды бір-біріне немесе мүшелерді ұлпаларға телуді қолданады. Жақсы өсіп тұрған ұлпалар мен мүшелерден бөлініп шыққан кейбір заттар, тәжірибеге алынған өсімдік өсуін жылдамдатады.

Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі өсімдіктің өсуі клеткалардың, ұлпалардың және мүшелердің өсуінен тұрады. Солай бола тұрса да, қандай да болсын өсудің негізі клеткадан басталады. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі клетканың өсуі бірінен соң бірі кезекпен келіп тұратын процесстерден тұрады: клетканың бөлінуі, протоплазманың өсуі, созылуы және дифференциялануы. Өсу процестері негізінен меристемада жүреді.

Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі клетка бөлінгеннен кейін, әрбір жас клетканың алдында үш мүмкіндік болады.

1. Эмбриондық жағдайда қалып, клетка цикліне түсіп, митоз арқылы қайта бөліне алады.

2. Циклден тыс қалып, /О₀/бөлінбей, тыныштық кезеңіне өтеді.

З. Компетенцияға иеленіп жаңа бағыты біртіндеп айқындалып одан кейін ерекшелену /дифференциялану/ жолына түседі.

Компетенция- клеткалардың, ұлпалардың, мүшелердің, организмнің индукторлық әсерді қабылдап алуға кабілеттігі және әсер еткен факторға жауап ретінде өзінің даму бағытын өзгертуі.

Өзгерістерді әр түрлі факторлар туғызуы мүмкін. Мысалы: гормондар, көрші клеткалардың немесе басқа ұлпалардың, метаболиттері, электрофизиологиялық сигналдар және т.б.

Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі белгілі бір тұқым куалауды жүзеге асыруға әзір тұру қалпына тусуі-детерминация деп аталады. Қабілеттілігі бар клеткалық детерминациялануы оның дамуының белгілі бір жолын калыптастырады да, жетілудің басқа бағыттарда жүруін тежейді. Қабілетті клетканың детерминациялануы клетка бөлшегінен кейін бірден басталуы мүмкін яғни протоплазманың өсуі алдында. Белгілі бір ретпен детерминацияланған клетка өте бір тар мамандыққа ие болады яғни дифференцияланады (қандай да бір ұлпаның клеткаларына айналады).

Дифференциация - жас клеткалар арасындағы құрылысы мен кызметі жағынан болатын өзгерістерді,аналық клеткалары мен жаңа пайда болған клеткалар арасында айырмашылықтарды тудыратын күрделі процесс. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі клеткалар атқаратын қызметі және құрылысы жағынан біркелкі, дифференциялану нәтижесінде әр жолдармен дами бастайды да,түрлі мүшелердің ұлпаларын түзеді. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі ДНҚ-ы молекуласында шифрленген генетикалық информацияның іске асуы арнайы и-РНҚ түзілуі /транскрипция/ арқылы және одан кейін генетикалық кодына сәйкес белоктар синтезі /трансляция/ арқылы жүретіні белгілі. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі бірақ, барлық генетикалық информация бір уақытта іске аспайды, клетканың өсу және дифференциялану процесстері кезінде қатаң тәртіппен кезектесіп көрініп отырады. Биобалистика әдісі арқылы өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі геномдағы гендердің бір тобы бір кезеңде активті болады, яғни иРНҚ-ның мағыналы өнімі бар, ал келесі бір тобы активтілігін көрсете алмайды, себебі, ондай гендер активтілігі репрессор әсерінен тежелген. Сондықтан, клеткалар арасындағы айырмашылықтар, яғни олардың дифференциаялануы гендердің әр түрлі дифференциалды/ активтенуіне байланысты.

Морфогенез дегеніміз пішін /форма/ құру процесі, онда өсімдік мүшелерінің бастапқы элементтерінің құрылуы, өсуі және өнуі /органогенез/, ұлпалардың /гистогенез/ жөне өсімдік клеткаларының жетілуі /цитогенез/ немесе клетканың дифференциялануы жүреді. Морфогенез көп кезеңдерден тұратын күрделі процесс.

Организмнің дамуы - өсу, дифференциалануы, морфогенез процесстерінің бір - бірімен тығыз байланыста жүруінің нәтижесінде болады. Бүтін организмде бұл процесстерді бір - бірінен ажыратып қарау өте қиын. Сонымен қатар, бұл процесстер бір - біріне мүлде ұқсамайды, әрқайсысының өзіндік ерекшеліктері бар. Атап айтқанда сандық өзгеріс және сапалық жағынан қайта құрылудың нәтижесінде кеңістікте құрылысы және формасы бар құрылым пайда болады, онда морфогенез процессі жүреді.

К. Уоддингонның анықтамасы бойынша, "Морфогенез дегеніміз - гомегендік, яғни жеке бөліктерден тұрмайтын массасының белгілі бір құрылымға айналуы". Тұтас организмде әр түрлі бөліктердің бір - біріне тигізетін әсерін камтамасыз ететін, көптеген корреляциялар, байланыстар болғандықтан, бұндай жүйеде морфогенездің көрінуін зерттеу өте қиын шаруа.

Өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі зерттеудің өте қолайлы моделі, ол ұлпаларды, клеткаларды және протопласттарды жасанды қоректік ортада өсіру. Моделді қолданып жүргізген зерттеулердің артықшылығын, ол өсірілетін клеткаларға бір бағытта әсер ету арқылы, зерттеуші түрлі факторлардың әсерін бақылай алады.

Каллустың пайда болуына əсер ететін факторлар

Жасушалардың өсуіне бірнеше физика- химиялық факторлар әсер етеді. Физикалық факторларға: температура, қысым, араластыратын айналу жиілігі, көбік түзілу, ау қабығының жылдамдығы, қоректік ортаны, субстратты беру жылдамдығы, тұтқырлығы; Химиялық факторларға: қоректік ортасының құрамы және рН көрсеткіштері, тотығу- тотықсыздану потенциалы, еріген оттегімен көмірқышқыл газының мөлшері, көміртегі, азот, фосфор, магний, калий, кальций, натрий, темір, т.б иондармен тұздар құнарлығы жатады. Қазіргі микробиологиялық өндірісте ең жиі қолданылатын реактор субстрат пен жасушалар араласатын резервуар болып табылады, онда реакциялар жүру үшін қолайлы жағдайлар жасалынады, температура мен рН көрсеткіштері реттеледі. Қоректік орта арқылы кейде оттегімен қаныққан, сүзілген ауа айдалады, химиялық және биологиялық талдау үшін екі тәсілі: 1. барлық кіретін саңылауларды залалсыздандыру. 2. реактор ішінде атмосфералық қысымнан артық қысым жасалыну қолданылады. Бірнеше сағаттан бірнеше күнге дейін созылатын үдеріс аяқталғанда, барлық қоспаны реактордан алып тастайды, өнімді бөліп, тазалауды жүзеге асырады (1- кесте).

1- кесте. Өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі көшетінің тауарлы өнімділігі мен сәндік бағасына қоректік орта мен себу тәсілінің әсері

№	Қоректік орта	Себу тәсілі	Өсім-діктің тығыз-дығы, дана/м2	Тауарлы өнім, дана/м2	Сәндік бағасы
1	Аммоный селитрасы-10 г/м2+ қос суперфосфат -20г/м2,+ хлорлы калий- 15г/м2	Шашып себу	1250	625	Нашар, сүйкімсіз
		Пунктирлі себу	870	609	жақсы
		Пластмас ыдысқа (стаканға) себу	650	595	Жақсы, тартымды
2	Аммоный селитрасы-10 г/м2+ қос суперфосфат -20г/м2,+ хлорлы калий- 15г/м2+ бор қышқылы- 0,2г/м2	Шашып себу	1230	639	Қанағаттанарлық
		Пунктирлі себу	860	633	Жақсы
		Пластмас ыдысқа (стаканға) себу	650	598	Жақсы, тартымды
3	Аммоный селитрасы-10 г/м2+ қос суперфосфат -20г/м2,+ хлорлы калий- 15г/м2+ бор қышқылы- 0,2г/м2	Шашып себу	1240	630	Қанағаттанарлық
		Пунктирлі себу	860	645	Жақсы
		Пластмас ыдысқа (стаканға) себу	640	615	Жақсы, тартымды

Оқшауланған жасушалар, ұлпалар, мүшелер өсуіне қоректік ортадан басқа да жағдайлар әсер етеді. Өсімдік жасушаларын қатты және сұйық ортада өсіру үшін, оның рН көрсеткішінің маңызы өте зор. Табиғи жағдайда жасушаның тіршілік әрекеттері сутегі иондарының қолайлы концентрациясында (рН 5,5- 7,5) өтеді. Қоректік орталардың буферлік сиымдылығы өте төмен, сондықтан олардың алғашқы рН көрсеткіші өсімдік жасушаларында өсіргенде тез бірнеше бірлікке жылжып кетеді. Соның арқасында жасушаның биосинтездік қасиеттері өнімдердің жиналуы өзгереді. Сонымен қатар, агарланған қатты қоректік ортаны дайындағанда агар қышқылы ортада ғана қатады, яғни агардың полимеризациясы рН 5-6 сәтті өтеді.

Өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі жасушаларын өсіру үшін 25 ⁰С температура қажет. Жасушалардың өсуіне әсер ететін сыртқы факторлардың бірі- жарық. Жалпы in vitro жағдайында өсірілетін өсімдік жасушаларында жасыл пигмент хлорофилл түзілмейді, сондықтан олар әдеттегідей фототрафтық жолмен емес гетеротрофты қоректенеді. Жасушаларда қосымша заттар түзілуіне жарықтың сапасы, қарқындылығы және фотопериодтың әсер ететіндігі дәлелденген, сондықтан жасушалық технологияны жасаудағы басты мақсаттардың бірі- жасушаларды өсіру үшін қажетті жарықтың сапасы мен қарқындылығын анықтау.

Өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі өсуіне аэрацияның әсері зор (бұл тұрғыда арнайы суспензияға қажет). Аэрация болмаса, жалпы алғанда, суспензияның өсуі мүмкін емес. Клеткалар суспензиясы (лат. Suspension- асып қою)- жеке жасушаларды немесе кішігірім жасушалар тортарын аппаратура арқылы ауамен қамтамассыз етіп және араластыра отырып сұйық қоректік ортада өсіру. Өсімдік трансформациясын жүргізілу тиімділігі өсіргенде қоректік ортаның осмос қысымын да ескеру керек. Жоғары осмос қысымы қоректік заттарды жасушалардың сіңіруін қиындатады. Экспланттан пайда болған морфогенді каллус ұлпаларды әрбір 3-4 апта сайын жаңа қоректік ортаға көшіріп отырса, олар шексіз ұзақ өсе береді. Осындай морфогенді каллусты жарықта, 27 ⁰С температурада өсіргенде регенерант- өсімдік дами бастайды.