4. Мембранные потенциалы: пп, пд, впсп, тпсп, мпкп, пкп и т. Д.

Любого здравомыслящего читателя набор аббревиатур, вынесенных в заголовок этой главы, должен привести в чрезвычайно унылое состояние. Просим набраться терпения: очень скоро Вы увидите, что всё не так мрачно, как кажется с первого взгляда.

Прежде всего речь в этой главе пойдёт о главной электрической составляющей информационных процессов в нервной системе и в возбудимых тканях вообще. Мы будем отвечать на вопрос, поставленный в конце главы 1: что такое мембранный потенциал и как и почему он может меняться?

Напомним, что главным «языком» мозга является язык нервных импульсов, или импульсный код (рис. 17).

Рис. 17. Простая имитация импульсной активности нейрона, созданная с помощью всего двух клавиш компьютера. Можно утверждать, что при наличии соответствующей регистрирующей аппаратуры сейчас, в это мгновение, в Вашей голове можно было бы обнаружить нейрон, разряжающийся именно в таком режиме.

На рисунке хорошо видно, что после каждого импульса возникает пауза, которая иногда длится мгновение, сопоставимое по длительности с самим импульсом, а иногда растягивается на довольно солидный отрезок времени. Эта пауза называется межимпульсным интервалом и отражает состояние относительного покоя мембраны клетки. Заметим, что чередование импульсов и межимпульсных интервалов (так называемый рисунок паттерна) является одним из возможных кодов нейрона, хотя его роль в обработке информации, судя по всему, весьма невелика. Для нас же сейчас важно выяснить, каким электрическим характеристикам мембраны соответствует состояние её покоя и активности (в момент генерации импульса).

4.1. Потенциал покоя (пп) мембраны и причины его возникновения

Постарайтесь представить себе достаточно несложный по сегодняшним возможностям эксперимент. Прежде всего, что Вы будете делать, чтобы померить напряжение в сети, от которой питается Ваша настольная лампа? Думается, многим из Вас знаком прибор под названием тестер (официально он называется омампервольтметр или как-то похуже), в котором есть непосредственно измеритель (в простейшем варианте струнный гальванометр) и два провода — электрода, кончики которых мы можем аккуратно ввести в электрическую розетку. Обнаружив, что измеритель показал 205—210 В (на 220 рассчитывать не очень приходится, учитывая, что в нашей стране всё воруют), мы сразу успокаиваемся: напряжение измерено. А теперь представьте себе, что Вам надо померить напряжение (давайте начнём пользоваться более «физиологичным» понятием — потенциал) на мембране нейрона. Принцип-то измерения будет точно таким же: нужен измеритель и нужны электроды. Только надо учесть миниатюрность всего того, что мы собрались измерять, поэтому и электроды будут особо тонкими (микроэлектроды), и сам измеритель гораздо чувствительнее, чем для бытовых нужд. Ведь в нейронах (забегаем вперёд) потенциалы на 3 порядка слабее, чем в розетке: милливольты (мВ), а не вольты.

Как раз теперь самое время поговорить о методах измерений электрических процессов в живых системах. В принципе не так уж и важно, что мы меряем: потенциалы отдельных нейронов (или даже участков их мембраны), их больших или сравнительно небольших скоплений — модулей (так называемые фокальные потенциалы), суммарные потенциалы больших участков мозга (например, ЭЭГ — электроэнцефалография), потенциалы сердца (ЭКГ — электрокардиография), или что-то другое. Подход к измерениям достаточно стандартен (рис. 18).

Рис. 18. Принципиально необходимые компоненты современной электрофизиологической аппаратуры (объяснения в тексте).

Нужны электроды для отведения потенциала от объекта измерения. Если объект маленький, используются микроэлектроды (как правило, стеклянная микропипетка, заполненная каким-то электролитом, например, KCl), если покрупнее — макроэлектроды. Так как потенциалы и токи в живых системах очень слабы, необходимо уметь их усиливать при регистрации. Поэтому во всей электрофизиологической аппаратуре есть специальные усилители. При усилении сигнала возникает серьёзная проблема: вокруг нас очень много всяческих электрических и радиотехнических приборов (радиотелефоны, телевизоры, пылесосы, трамваи и прочие достижения цивилизации), создающих массу помех; «шумят» и живые клетки. Усиливая интересующий нас сигнал, мы автоматически усиливаем и сопровождающие его шумы. И здесь есть опасность вообще потерять сигнал в этом море помех.

Поэтому в современных электрофизиологических приборах обязательно присутствуют специальные фильтры, позволяющие вырезать сигнал из шума. И, наконец, зарегистрированный, усиленный и очищенный от помех сигнал надо как-то увидеть и зафиксировать, то есть сохранить. Так как сегодня аппаратура для измерений компьютерная, с этим проблем нет. Надо только преобразовать те электрические изменения, которые мы поймали нашими электродами (так называемый аналоговый сигнал), в цифровую форму, понятную компьютеру. Это умеют проделывать АЦП — аналогово-цифровые преобразователи (есть, кстати, и обратные преобразователи — ЦАП). Теперь уже ничто не помешает увидеть зарегистрированные биопотенциалы на экране монитора компьютера, записать их в память, обработать любым способом и т. д.

Однако вернёмся к нашему эксперименту. Представьте себе, что мы получили возможность поработать с отдельным нейроном. Не слишком важно, что это за нейрон, и каким конкретным методом мы будем к нему подбираться. Это может быть нервная клетка одного из отделов мозга (рис. 19), до которой мы добрались, предварительно занаркотизировав (подобно операционному наркозу в хирургических клиниках) животное, закрепив его голову в специальном станке (стереотаксисе), сняв участок скальпа, проведя трепанацию черепа (проще говоря, просверлив череп в строго определённом месте) и с по мощью микроманипулятора введя микроэлектрод в чётко известную структуру мозга (вводить мы его будем по координатной сетке трёхмерного атласа — такие атласы есть практически для всех лабораторных животных).

Это может быть один из нейронов тончайшего переживающего среза одной из мозговых структур (переживающими такие срезы — слайсы = slices — называют не за особую эмоциональность, а за то, что в искусственно созданной среде эти мозговые срезы надолго переживают своего хозяина — крыску, хомячка, морскую свинку и т. д.).

Это может быть одна из клеток культуры нервной ткани: для тех, кто наслышан про пресловутое клонирование, возможность выращивания в чашке Петри целой популяции одинаковых клеток из одной первоначально взятой не кажется фантастикой.

Наконец, это может быть периферический отросток (лучше —аксон) нервной клетки какого-нибудь животного; первые эксперименты, подобные обсуждаемому нами, так и делались: в 40—50-е годы ХХ века великолепная группа физиологов под руководством Алана Ходжкина смогла понять механизмы возникновения биопотенциалов благодаря работе на гигантском аксоне кальмара (сами-то кальмары не были гигантскими, просто для эффективной работы реактивного двигателя этого животного — колокола, из-под которого «выстреливает» вода, — нужна очень высокая скорость распространения нервных импульсов вдоль колокола, а чем больше диаметр волокна, тем быстрее по нему бегут импульсы, поэтому у знакомых всем по салатам кальмаров аксоны мотонейронов можно увидеть невооружённым глазом).

Рис. 19. Вполне правдоподобный рисунок, воспроизводящий принцип микроэлектродного отведения потенциалов от одиночного нейрона.

Итак, наша первая насущная задача — выяснить, есть ли на мембране аксона, находящегося в состоянии покоя (во время межимпульсного интервала), какой-либо электрический потенциал, и если есть, то какой. Используем уже упоминавшийся микроэлектрод. Подводим его кончик непосредственно к мембране аксона. Второй электрод — здесь вполне подойдёт и макроэлектрод — помещаем где-то поблизости, не очень заботясь о точности его расположения: так как нам нужно мерить разность потенциалов, обязательно нужны два электрода — активный (микроэлектрод) и индифферентный (можно макро-). Подсоединяем оба электрода к измерительной аппаратуре, включаем и… на нашем мониторе мы видим тоскливую прямую: разность потенциалов (давайте говорить проще — потенциал) равна нулю, то есть её просто нет при расположении обоих электродов снаружи от мембраны (рис. 20).

Теперь начинаем осторожно, с помощью микроманипулятора, опускать микроэлектрод. В какой-то момент его кончик проткнёт мембрану и войдёт внутрь нервной клетки (не надо пугаться: ведь мембрана — это жидкий бислой липидов, так что с нейроном ничего не случится; вспомните: «нож сквозь масло»). И именно в этот момент мы увидим на экране резкий скачок уровня потенциала — до 60—70 мВ, причём, судя по показателям, внутренняя поверхность мембраны окажется заряженной отрицательно по отношению к наружной поверхности.

мВ

Рис. 20. Измерения мембранного потенциала нейрона в состоянии покоя, то есть во время межимпульсного интервала. Пока микроэлектрод находится на поверхности мембраны, регистрируется отсутствие значимой разности потенциалов между ним и макроэлектородом, который может находиться достаточно далеко от данного нейрона. Как только с помощью микроманипулятора мы опускаем кончик микроэлектрода и «входим» под мембрану (этот момент обозначен стрелкой), наша измерительная аппаратура улавливает резкий скачок потенциала: внутренняя поверхность мембраны оказывается значительно (на десятки милливольт) более электроотрицательной, чем наружная. Это и есть потенциал покоя мембраны (ПП).

Итак, установлен первый вполне конкретный научный факт: во время межимпульсной паузы, в состоянии релаксации, покоя, внутренняя поверхность мембраны нейрона заряжена отрицательно относительно наружной, и уровень этого потенциала колеблется (в зависимости от условий конкретного опыта) около 60—70 мВ. Поздравляю: мы зарегистрировали ПП — потенциал покоя мембраны!

На конкретные значения ПП не стоит обращать особого внимания: в зависимости от того, какую возбудимую клетку мы обследуем, у какого животного, в каких условиях, значения могут несколько меняться. Здесь важно другое: устойчивый, всегда воспроизводимый факт наличия отрицательного электрического заряда на внутренней поверхности мембраны. Откуда же он взялся? Для ответа на этот вопрос вспомним недавний разговор про мембрану и её свойства. И снова речь пойдёт об особенностях химического градиента ионов по разные стороны мембраны и об ионных каналах.

В своих, ставших сегодня уже классическими экспериментах сотрудники группы Ходжкина обнаружили, что в состоянии покоя на нейрональной мембране открыты каналы одного-единственного вида: K⁺-поры. Давайте ещё раз вспомним, что означает такое название: во-первых, это поры, стало быть, ворота у них отсутствуют, и они открыты всегда; во-вторых, это K⁺-каналы, то есть они пропускают почти исключительно ионы K⁺ по градиенту концентрации. А как направлен химический градиент K+? Изнутри наружу клетки. То есть ионы K⁺ будут выходить через эти каналы наружу (рис. 21). А теперь самый ключевой вопрос: до каких пор будет происходить этот выход K⁺?

Ответ, казалось бы, напрашивается сам собой: до тех пор, пока концентрация этих ионов по разные стороны мембраны не станет одинаковой. И этот ответ был бы верным (ведь он вполне в русле термодинамических законов), если бы не одно существенное обстоятельство: мы имеем дело не с простыми электрически нейтральными веществами, а с ионами. А в этом случае устранение одной «несправедливости» (неравенства концентраций) неизбежно приведёт к возникновению другой «несправедливости» — неравенству электрических зарядов по разные стороны мембраны. Ведь с каждым выходящим из клетки по градиенту концентрации ионом K⁺ клетка одновременно теряет и положительные заряды, которые перетекают на наружную поверхность мембраны (рис. 22).

Рис. 21. В состоянии покоя ионы K⁺ через поры выходят из клетки по градиенту концентрации.

Рис. 22. Выход ионов K⁺ из клетки по градиенту концентрации приводит к созданию электрического градиента на мембране: внутри клетки накапливаются «осиротевшие» белковые анионы (следовательно, отрицательные заряды), а снаружи катионы K⁺, то есть положительные заряды.

То есть в клетке формируется дефицит плюсов (зато избыток минусов — не забывайте, например, про белковые анионы, которым через каналы не пройти при всём желании), а вокруг неё — избыток тех же самых плюсов. Стало быть, возникает электрическое неравновесие, электрический градиент на мембране

Вернёмся к ключевому вопросу: до каких же пор возможен выход ионов K⁺ из клетки? Если до сих пор не догадались, попробуем вспомнить младшешкольную физику. Мы с Вами стараемся понять механизмы, формирующие ПП мембраны. При каких условиях некое вполне материальное тело находится в состоянии покоя (или равномерного прямолинейного движения — что, по существу, одно и то же)?

Представьте себе, что на Вашем письменном столе лежит книжка. Почему она не падает на пол и не взлетает к потолку? Надеюсь, Вы вспомнили: потому что силы, действующие на эту книжку, равны и направлены в противоположные стороны (рис. 23). Сила тяжести тянет эту книжку вниз, а сила сопротивления (противодействия) опоры (стола) столь же решительно препятствует этому.

Рис. 23. Книжка будет спокойно лежать на столе при условии равновесия двух диаметрально противоположно направленных сил: силы тяжести (Fтяж) и силы сопротивления опоры (Fсопр).

Какое это отношение имеет к ионным процессам на мембране нейрона? Самое прямое! Мы с Вами стараемся понять механизмы, формирующие потенциал покоя (ПП) мембраны. Мы (вслед за группой Ходжкина) выяснили, что в покое на мембране формируются две силы: химический градиент ионов K⁺ (провоцирующий выход этих ионов из клетки через поры) и встречный электрический градиент (то есть потенциал), связанный с потерей клеткой положительных зарядов. Тогда становится понятным, что условием равновесного («спокойного») состояния мембраны является равновесие этих двух диаметрально противоположно направленных сил (рис. 24).

Необходимо подчеркнуть два момента: во-первых, когда мы говорим о выходе ионов калия из клетки и «выстраивании» их по наружной поверхности мембраны, речь идёт исключительно о тончайшем примембранном слое, чуть дальше в межклеточном пространстве концентрация K+ по-прежнему будет значительно ниже, чем внутри клетки. Во-вторых, описанное нами на качественном уровне объяснение механизма формирования ПП может быть представлено гораздо строже, если мы воспользуемся так называемым уравнением Нернста.

Рис. 24. Потенциал покоя (ПП) или равновесный калиевый потенциал (EK), существующий на мембране возбудимой клетки в период межимпульсного интервала, уравновешивает химический градиент по калию ([K⁺нар] / [K⁺внутр]).

Вопреки прозрачным намёкам некоторых учебников немецкий учёный Нернст не был физиологом (тем более — нейрофизиологом, ведь в XIX веке эта наука только зарождалась); он был выдающимся физхимиком. И своё уравнение диффузии ионов через полупроницаемые мембраны он вывел как общую закономерность, а вовсе не для описания транспорта K⁺ через нейрональную мембрану. Но знаменитым стало именно нейробиологическое приложение его закона. Итак, что же это за формула?

EK = (R  T / F  Z)  ln ([K⁺нар] / [K⁺внутр]),

где EK — электрический потенциал мембраны по K⁺,

R — газовая постоянная,

T — абсолютная температура,

F — число Фарадея,

Z — валентность иона K⁺,

[K⁺нар] / [K⁺внутр] — градиент концентрации ионов K⁺ снаружи и внутри клетки.

Учитывая, что эта книга написана в том числе и для убеждённых гуманитариев, постараемся помочь им преодолеть священный ужас перед любыми формулами. Вглядитесь повнимательней: первые четыре переменные в данном уравнении — это вполне конкретные численные значения, которые легко можно найти в любом физическом или химическом справочнике. Логарифмирование — не более чем математический приём.

Что же тогда остаётся? То, что равновесный калиевый электрический потенциал на мембране нейрона при стандартных условиях зависит от соотношения концентрации ионов K⁺ снаружи мембраны к их концентрации внутри:

EK  – ([K⁺нар] / [K⁺внутр]).

Значком  мы рискнули обозначить некое принципиальное соответствие правой и левой частей выражения, потому что знак равенства ставить теперь мы уже не имеем права; а минус перед правой частью выражения неизбежно должен был появиться при уходе от логарифмирования (вспомните: при логарифмировании дроби, в которой числитель меньше знаменателя, получается отрицательное число). Таким образом, при анализе уравнения Нернста смысловое содержание нашего качественного рассуждения вполне подтвердилось. Хочется ещё раз подчеркнуть, что формализация электрохимического сопряжения приложима ко всем вариантам ионных токов через мембраны. Не случайно на базе полного уравнения Нернста (в него входят ионные градиенты не только для калия, но и для натрия и хлора) Гольдманом, а чуть позднее Ходжкиным, Хаксли и Катцем были прописаны уравнения «постоянного поля» нейрона, ставшие сегодня одной из основ математического моделирования электрических процессов на мембране нейронов (заметим в скобках, что к передаче информации подобного рода модели имеют самое прямое, но — увы! — пока ещё весьма далёкое отношение).

Если у Вас сложилось впечатление, что с причинами возникновения ПП теперь всё ясно, вынужден Вас огорчить. Оказывается, если действительно подставить в уравнение Нернста все необходимые численные значения, то вычисленный уровень ПП окажется не совсем таким, как экспериментально измеренный.

Несложные вычисления приведут к значениям EK  –85 мВ, а реальные измерения дают, как Вы помните, цифры около –60—70 мВ. Почему такое расхождение, нет ли ошибки в самой гипотезе?

И да, и нет. Нет, потому что бесчисленные измерения абсолютно однозначно показывают, что именно калиевый ток через мембрану является главным, доминирующим фактором формирования ПП. Да, потому что мы имеем дело с живой системой, в которой не может быть ничего абсолютного. Сегодня хорошо известно, что в покое мембрана нейрона пропускает по градиентам концентраций не только ионы калия, но и натрий, хлор и т. д. Другое дело, что их суммарный вклад в конечный уровень ПП невелик, хотя и, как Вы видите, заметен.