Материалы и методы
Все эксперименты проведены в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» (публикация Национального Института Здоровья № 85–23, США) и «Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» [4].
Материал исследования. Эксперименты выполнены на крысах–самцах линии Wistar массой 260–330 г (питомник «Рапполово»), содержавшихся в условиях 12/12 часового светового режима и получавших стандартный корм и питьевую воду ad libitum2. Фотография, снятая в ходе одного из экспериментов, представлена на рис. 2.
Рис. 2. Подопытное животное на термостатируемом операционном столике
Анестезия. В качестве вводной анестезии использовалось внутрибрюшинное введение пентобарбитала натрия в дозе 60 мг/кг (Pentobarbitalnatrium, Apoteket, Umea, Швеция). В качестве поддерживающей анестезии во всех экспериментах использовали внутривенную инфузию раствора пентобарбитала натрия для достижения хирургического наркоза.
Моделирование ишемии–реперфузии миокарда. Эксперименты проводились при искусственной вентиляции легких через трахеостому (SAR–830Р, Stoelting, США, частота дыхания – 50/мин., дыхательный объем в пределах от 1,5 до 3 мл/100 г массы). Доступ к сердцу производили путем торакотомии в четвертом межреберье слева, вскрывали перикард и, ориентируясь на медиальный край ушка левого предсердия слева и конус легочной артерии справа, определяли локализацию общего ствола левой коронарной артерии (ЛКА), под который с помощью атравматической иглы (6–0) подводили полипропиленовую лигатуру (Cardiopoint, CV–301). Для создания обратимой ишемии миокарда формировали окклюдер3: концы лигатуры, охватывающей коронарную артерию, проводили в просвет полиэтиленовой трубки диаметром 1 мм и длиной 5–6 см (PE 40), после чего путем смещения трубки к сердцу добивались окклюзии4 ЛКА, а в противоположном направлении – реперфузии5. С целью поддержания окклюзии в течение 30 минут на трубку накладывали зажим. В ходе эксперимента животные находились на термостатируемом операционном столике; при этом температура тела животного поддерживалась в пределах 37,0±0,5ºС.
Измерения. В ходе экспериментов непрерывно измерялось артериальное давление (АД) специальным датчиком давления (Baxter, США), соединенным с усилителем, через гепаринизированный катетер, введенный в аорту через общую сонную артерию, и регистрировали на персональном компьютере с помощью программного обеспечения PhysExp 2.0 (свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2004612138 от 17.09.04). Регистрация частоты сердечных сокращений (ЧСС) осуществлялась в исходном состоянии, после торакотомии, перед окклюзией ЛКА, на 15 и 30 минуте окклюзии ЛКА, на 30 и 60 минуте реперфузии, а также в конце эксперимента, т. е. через 90 минут после реперфузии ЛКА.
В ходе эксперимента у животных регистрировали электрокардиограммы на экспериментальном компьютеризированном электрокардиографе «СВР-2К», реализующем метод ЭКГ СВР. Этот электрокардиограф был специально разработан и изготовлен в НОЦ БРЭИ для записи, отображения и обработки информации в процессе проведения данной серии экспериментов на животных. Регистрировались ЭКС в НЧ- и ВЧ-каналах «СВР-2К», а также в режиме реального времени каждые 30 секунд производился расчет в последних десяти кардиоциклах спектральной плотности мощности составляющих ЭКС в ВЧ-канале.. Использование в ходе данного цикла экспериментов для текущего контроля в режиме реального времени именно спектральной плотности мощности составляющих ЭКС в ВЧ-канале было вызвано тем, что в проводившихся ранее исследованиях в Великобритании [5, 6] и в США [7, 8] в области регистрации и анализа ВЧ-компонентов ЭКС для исследования возможности диагностирования ИБС было показано, что пациенты с выраженной ишемией имеют гораздо больше ВЧ-компонентов в электрокардиограмме, чем здоровые.
Кроме того, регистрировались ЧСС и контрольная ЭКГ кардиографом «Кардиотехника–8» по стандартной методике в стандартных отведениях I, II, III.
Анализ аритмий. Анализ частоты возникновения и тяжести ишемических и реперфузионных желудочковых тахиаритмий (ЖТА) проводился в соответствии с международным соглашением Lambeth Conventions [9], представляющем собой инструкции по трактовке и учету экспериментально индуцированных нарушений ритма. Механическая и электрическая дефибрилляция, а также какие–либо антиаритмические препараты для купирования возникающих ишемических и реперфузионных нарушений ритма в данном исследовании не применялись.
Методика определения размера анатомической зоны риска и зоны инфаркта. С целью верификации факта возникновения ишемии миокарда в отдельной серии острых экспериментов (n=5), а также для количественной оценки воспроизводимости результатов, проводили оценку размеров анатомической зоны риска и зоны инфаркта с помощью методики «двойного окрашивания» синим Эванса и трифенилтетразолием хлоридом (ТТС) (MP Biomed., США) [10]. В указанной серии экспериментов продолжительность ишемии составляла 30 минут, а реперфузии – 90 минут. Данные по размерам зоны риска и инфаркта представляли в виде отношения объема зоны риска к общему объему сердца, а также в виде отношения объема зоны инфаркта к объему зоны риска (в процентах).
Обработка данных. Записи ЭКГ для их последующей обработки с целью уменьшения влияния помех и устранения артефактов, а также для вычисления спектральных плотностей мощности составляющих ЭКС в НЧ- и ВЧ-каналах обрабатывались с помощью программных пакетов MatLab и MathCad.
Статистическая достоверность различий функциональных данных в каждой временно́й точке, а также размеры анатомической зоны риска и зоны инфаркта оценивалась с помощью программного пакета SPSS (ANOVA, тест Шеффе). Категориальные данные, в частности, частота возникновения нарушений ритма, сравнивались с помощью теста Фишера. Все функциональные данные выражались в виде «среднее стандартное отклонение».