14Красители в микробиологии. Простое окрашивание бактерий.

Большинство красителей, используемых в микробиологии, является солями двух типов. У кислых красителей ион, придающий окраску (хромофор), является кислотой и при окрашивании более интенсивно связывается с цитоплазматическими (основными) компонентами клетки, например эозин. У основных красителей роль хромофора играет катион. Будучи основанием, он более интенсивно связывается с ядерными (кислыми) компонентами клетки, например метиленовый синий. Некоторые красители не образуют химических соединений, а просто растворяются или осаждаются на окружающем материале. В механизме окрашивания имеют значение как химические, так и физические процессы.

Для окрашивания бактерий чаще используют основные красители: метиловый синий, кристаллический фиолетовый, основной фуксин, тионин. Широко используют щелочной раствор метиленового синего — краситель Леффлера, позволяющий выявить многие детали формы и структуры микробов.

Однако для выявления спор, капсул, жгутиков, различных структур и органелл, а также сходных по форме бактерий использование для окрашивания только одного красителя (простой способ окраски) бывает недостаточно. Поэтому существуют сложные, специальные методы окрашивания, удовлетворяющие различным требованиям.

15.Грам + и – бактерии. Особенности сложного окрашивания.

Сущность метода Грама

Основой метода Грама является принцип разделения бактерий на микроорганизмы со знаками «плюс» и «минус» по Граму, основываясь на разном химическом составе клеточных стенок микроорганизмов.

Для определения грамположительных и грамотрицательных бактерий препарат, нанесенный на стекло тонким равномерным слоем, вначале фиксируют с помощью нагревания над горелкой. Затем окрашивают анилиновым красителем – метиловым фиолетовым. После чего фиксируют йодом, дают подсохнуть и смывают при помощи спирта.

Грамположительные (Грам +) виды приобретают ярко-синюю окраску.

Грамотрицательные (Грам –) бактерии обесцвечиваются.

Заключающим этапом является окрашивание препарата контрастным красителем красного цвета, который позволяет получить грамотрицательные микроорганизмы красного или розового цвета. Это обусловлено тем, что краситель не может проникнуть в клетку из-за толстого ее внешнего слоя, окрашивая только поверхность.

Окрашивание по Граму

Окрашивание по Граму. Кокки (шаровидные) — грамположительные и бациллы (палочки) — грамотрицательные

Мертвые микробы приобретают более яркую окраску, по сравнению с живыми.

Характеристика бактерий, положительных по Граму

Большинство грамположительных бактерий являются патогенными для человека. Это возбудители опасных заболеваний:

• Стрептококк (Streptococcus), вызывающий тонзиллиты, фарингиты, ревматизм.

• Стафилококк (Staphylococcus) – возбудитель заражения крови, кожных гнойных заболеваний.

• Листерия (Listeria), вызывающая листериоз – воспаление мозга.

• Бациллы (Bacillus) – возбудители токсикоинфекций, сибирской язвы.

• Клостридии (Clostridium), вызывающие ботулизм, столбняк, газовую гангрену.

Два последних вида являются спорообразующими анаэробами, остальные не могут образовывать спор. Некоторые способны окрашиваться только в фазе активного роста.

Отрицательные бактерии по Граму

Это полностью обесцвечивающиеся после промывки спиртом бактерии; в результате повторной окраски сафранином приобретают розовый или ярко-красный цвет. Они более устойчивы к антителам, чем виды Грам +.

К грамотрицательным относятся в основном бактерии условно патогенные, способные вызвать воспалительные процессы и иммунный ответ в организме человека при определенных условиях. Их клеточная оболочка, состоящая из липополисахаридного слоя, вызывает синтез цитокинов, что способствует увеличению токсинов в месте локализации воспаления. Впоследствии токсины, разнесенные с кровотоком, отравляющим действием вызывают сильнейшие симптомы интоксикации.

16. Бактериальная капсула Поверхностная структура клетки

В прокариотических клетках (безъядерных) нет внутреннего разделения, т.е. функции всех «внутренних органов» у бактерий выполняет мембрана. Она может образовывать глубокие внутренние складки, но все равно остается оболочкой клетки. По сути, нормально функционирующая бактерия имеет следующее строение:

• цитоплазма (внутреннее содержимое клетки);

• оболочка (мембрана);

• поверхностные структуры (капсула, жгутики, микроворсинки).

• Строение бактериальной клетки

Капсула клетки – поверхностная слизистая структура, образующаяся вокруг оболочки. Это аморфное вещество имеет большое значение для жизнедеятельности клетки, делает оболочку более прочной и плотной, служит защитным барьером на пути фагоцитов, иногда выполняет роль кладовой и хранит запасы пищи. В строении капсулы различают два слоя: внутренний и наружный. Внутренний слой – часть наружного слоя цитоплазмы клетки, а наружный – результат секреторной функции бактерии.

Виды капсул

Продукты биосинтеза бактерии откладывают вокруг клеточной оболочки в виде своеобразного кокона, поддерживающего жизнедеятельность клетки. В зависимости от толщины слизистого слоя различают:

• Микрокапсулы. Слой слизи меньше 0,2 мкм. Выявляется только с помощью электронного микроскопа.

• Макрокапсулы, имеющие стенки толще 0,2 мкм. Их уже можно рассмотреть в обычный микроскоп, но для выявления слизистой структуры понадобится специальная окраска негативным методом.

Не все микроорганизмы обладают способностью образовывать верхний слой в виде аморфного кокона. Некоторые бактерии образуют их в любых условиях (истинно капсульные бактерии), но для большинства образование капсул – метод защиты от окружающей среды.

Для микроорганизмов защитные оболочки имеют большое значение:

• они образуют влажную среду, в которой клетка чувствует себя более комфортно;

• аморфное строение кокона защищает клетки от высыхания и предохраняет их от механических повреждений;

• увеличивают способность бактерий сцепляться друг с другом или с другими поверхностями, т. е. увеличивают их адгезию;

• выполняют функции иммунного барьера, т. е. препятствуют проникновению в клетку фагов (вирусов для микроорганизмов).

Клетки, имеющие капсулу, способны выжить в неблагоприятных условиях. Особенно ярко это выявляется на примере патогенных микробов. При попадании в организм некоторые бактерии тут же обзаводятся рыхлой стенкой, защищающей их от иммунной системы макроорганизма (человека или животного), тогда как во внешней среде они превосходно существуют в своем обычном виде. В случае с патогенными бактериями наличие капсулы затрудняет антибиотикам проникновение в клетку и, соответственно, мешает организму победить болезнь.

Капсулы бактерий

Если бактерии соединены в колонию, то оболочка помогает осуществлять связь между отдельными клетками и выполняет функции их соединения между собой. Вязкая субстанция капсулы также имеет значение для крепления клетки или колонии к другим поверхностям. Внеклеточные полимерные вещества, накапливаемые в капсуле, можно применять на практике. Так, их используют для получения искусственной плазмы крови или для выращивания тончайших синтетических пленок.

Выявление капсул

В строении капсулы принимает участие очень много воды, до 98%. Помимо того что жидкость делает кокон очень непрочным, она еще и прозрачна, т. е. рассмотреть гелеподобную оболочку под микроскопом обычным методом без дополнительной подготовки не получится.

В нормальном состоянии бактерии тоже прозрачны. Обычно для выявления клеток используют различные методы окраски, что позволяет легко рассмотреть их под микроскопом. Но для капсул обычные способы не подходят по нескольким причинам:

Слизистое вещество капсулы плохо задерживает красящие пигменты, после промывки препарата (это обязательная процедура при окрашивании) слизь остается бесцветной.

Аморфные оболочки очень мягкие и непрочные, в процессе окрашивания их легко повредить. При обычных методах окрашивания препарат подвергается механическим воздействиям, которые могут уничтожить сам объект исследования.

Одним из способов выявления такой непрочной субстанции является метод окраски по Гинсу. Он основан на неспособности капсулы удерживать краску и заключается в окрашивании окружающей среды и самой бактерии:

• на предметное стекло наносят каплю туши;

• добавляют в тушь куплю раствора, содержащего исследуемые клетки;

• перемешивают и аккуратно распределяют жидкость по поверхности;

• оставляют для высыхания на воздухе и фиксируют (обрабатывают сулемой, спиртом или быстро обжигают);

• погружают в раствор красящих веществ;

• промывают водой и высушивают.