2.5 Pi3k/Akt/pkb-зависимый механизм сигнализации

Другая важная система эффекторов белка Ras представлена сигнальным механизмом, включающим в себя киназы PI3K, Akt и PKB (Рис. 27). Отличительной особенностью этого механизма является то, что его запуск осуществляется путем фосфорилирования гликолипидного компонента мембраны, а не белковой молекулы, как это было в случае каскада Ras-Raf-MEK-Erk.

Как известно, в состав липидного бислоя клеточной мембраны входят сложные липиды, в состав которых могут входить фосфатные групп и/или углеводные компоненты. Одним из таких минорных фосфолипидов является фосфатидилинозитол, состоящий из глицериновой основы, к которой в положениях 1 и 2 присоединены две жирнокислотные цепи, а в положении 3 — фосфатная группа и шестиосновный циклический спирт инозитол. Остаток инозитола может подвергаться фосфорилированию по 3′-, 4′- и 5′-положениям при участии соответствующих киназ. После этого молекула фосфатидилинозитола может быть расщеплена при участии фосфолипазы С (PLC) с образованием фосфоинозитола (IP₃) и диацилглицерола (ДАГ), которые выполняют функции вторичных мессенджеров на внутриклеточном уровне. С другой стороны, фосфорилированный инозитол может остаться связанным с липидным компонентом мембраны, где он может участвовать в связывании тех или иных белковых факторов цитоплазмы (Рис. 28).

В настоящее время идентифицировано несколько киназ, способных фосфорилировать остаток инозитола в составе фосфолипидов. Однако, наиболее важным ферментом с точки зрения процессов сигнализации является PI3K, которая осуществляет фосфорилирование 3′-ОН группы в молекуле фосфатидилинозитол-(4,5)-дифосфата (PIP₂)с образованием фосфатидилинозитол-(3,4,5)-трифосфата.

Рис. 28 Строение молекулы фосфатидилинозитола и его биохимические преобразования в составе плазматической мембраны

Рис. 29 Механизм непосредственной активации PI3K при взаимодействии с Ras: Связывание Ras (оранжевый) через эффекторный домен с Ras-связывающим доменом PI3K (RBD; фиолетовый) делает возможным дополнительную активацию каталитического домена PI3K (красный и желтый), которые затем фосфорилируют PIP₂ с образованием PIP₃

Как было сказано выше, PI3K способна связываться с активированными рецепторами при участии SH2-домена. В тоже время было показано, что PI3K может также напрямую связываться с ГТФ-содержащим Ras (Рис. 29). Таким образом, PI3K может выступать в роли непосредственного эффектора Ras.

PI3K вовлечена во множество сигнальных механизмов. Подтверждением этому служит то, что данный фермент активируется многими сигнальными факторами, включая тромбоцитарный фактор роста (PDGF), фактор роста нервов (NGF), инсулиноподобный фактор роста-1 (IGF-1), интерлейкин-3, а также интегринами межклеточного матрикса.

Рис. 30 Миграция белков, содержащих PH-домены к PIP₃-остаткам в плазматической мембране

В этом эксперименте белок GFP (green fluorescent protein) был генно-инженерным методом сшит с белком, содержащим PH-домен. В течение 1 мин после стимуляции клеток фактором роста эпидермиса (EGF: epidermal growth factor) гибридный белок, изначально диффузно растворенный в цитоплазме (А), мигрировал в направлении мембраны клетки (Б). В отсутствии PH-домена (Г), стимуляция EGF не оказывала влияния на распределение GFP в клетке (Д) .

Фосфорилирование остатка инозитола не оказывает существенного влияния на структуру мембраны. Тем не менее, фосфорилированные остатки инозитола, экспонированные на внутренней стороне мембраны могут связывать некоторые белки цитозоля, что приводит к ассоциации этих белков в комплексы, необходимые для передачи сигнала внутрь клетки.

Наиболее значимой фосфорилированной формой инозитола является PIP₃, который специфически связывается с белками, несущими домен, гомологичный плекстрину (PH: pleckstrin homology domain), такими как PLC-δ (фосфолипаза С), Akt/PKB (серин-треонинкиназа) и BTK (Рис. 30).

Рис. 31 Механизм связывания PH-доменов белков с остатком PIP₃, экспонированным на внутренней поверхности плазматической мембраны

Полагают, что наиболее важным белком, содержащим PH-домены, является серин-треонин-специфическая протеинкиназа Akt/PKB. Таким образом, протеинкиназа Akt/PKB может связываться с остатком PIP₃образованным на внутренней поверхности мембраны при участии PI3K (Рис. 31).

После того как Akt/PKB связывается с PIP₃,она подвергается двойному фосфорилированию при участии киназ PDK1 и PDK2. Фосфорилирование Akt/PKB приводит к ее активации и, как следствие, к фосфорилированию ряда других сигнальных белков, что, в конечном счете, выражается в разнообразных клеточных реакциях. Основными биологическими эффектами Akt/PKB являются: 1) поддержание жизнеспособности клетки и подавление запуска механизмов апоптоза; 2) стимуляция клеточной пролиферации; 3) стимуляция клеточного роста (увеличение размера клеток) (Рис. 32). Кроме того Akt/PKB оказывает воздействие на мобильность клеток, однако механизм этого эффекта до конца не выяснен.

Рис. 32 Эпителий матки мышей линии Pten+/-. Данные клетки часто теряют вторую аллель гена Pten, в результате чего они получают генотип Pten-/- и формируют локальные гиперплазии и кисты. Иммуногистохимический анализ с использованием антител к PTEN (вверху)показал, что в правой части препарата клетки были лишены экспрессии PTEN. При этом они увеличивались в размерах, что указывало на эффект PIP₃-Akt/PKB. Иммуногистохимический анализ с использованием антител к фосфорилированной Akt/PKB (внизу) выявил в клетках правой части препарата высокую активность Akt/PKB, в то время как в левой части она была чрезвычайно низкой .

Процессы активации PI3Kи Akt/PKB находятся под жестким контролем. В клетках, пребывающих в состоянии покой, в отсутствие стимуляции факторами роста, внутриклеточный уровень PIP₃очень низок. В присутствии митогенов уровень PIP₃ резко возрастает. Низкий уровень PIP₃, а также других фосфорилированных форм инозитола в покоящихся клетках обеспечивается несколькими фосфатазами, которые катализируют реакции дефосфорилирования, обратные тем, что протекают под действием киназ, таких как PI3K. Наиболее полно исследованной фосфатазой такого типа является PTEN, которая удаляет 3′-фосфатную группу с молекулы PIP₃ (Рис. 31).

Разнообразие биологических эффектов Akt/PKB требует от данной киназы способности фосфорилировать различные белковые субстраты, каждый из которых является участником определенного сигнального каскада (Табл. 3). В частности, повышение жизнеспособности клеток определяется способностью Akt/PKB подавлять апоптоз.

Пролиферативные эффекты Akt/PKB определяются ее способностью активировать белки, играющие ключевую роль в регуляции клеточного цикла.

Табл. 3 Влияние Akt/PKB на выживаемость, пролиферацию и рост клеток

Биологический эффект	Субстрат Akt/PKB	Результат воздействия
Антиапоптозный	Bad (проапоптозный) Каспаза-9 (проапоптозный) КиназаIκB(антиапоптозный) FOXO1 TF(проапоптозный) Mdm2 (антиапоптозный)	Ингибирование Ингибирование Активация Ингибирование Активация
Пролиферативный	GSK-3β (антипролиферативный) FOXO4 (антипролиферативный) p21Clp1(антипролиферативный)	Ингибирование Ингибирование Ингибирование
Рост	Tsc2 (антиростовой)	Ингибирование

Независимо от пролиферативного эффекта Akt/PKB индуцирует значительные изменения в свойствах белков, регулирующих интенсивность синтеза белка. В частности, Akt/PKB фосфорилирует и тем самым инактивирует белок Tsc2, который, находясь в активном состоянии, выступает в роли триггера инактивации киназы mTOR, которая, в свою очередь, отвечает за инактивацию белка ингибитора трансляции 4E-BP. С другой стороны, Akt/PKB осуществляет индукцию активатора трансляции киназы p70S6. Данные модификации, вызванные Akt/PKB, приводят к активации синтеза белка и, как следствие, стимулируют клеточный анаболизм и рост. Примером ростового эффекта Akt/PKB может служить эксперимент, проведенный на трансгенной линии мышей, чьи β-клетки поджелудочной железы экспрессировали конститутивно активную форму Akt/PKB (Рис. 33). При этом размеры β-клеток увеличивались почти в двое в поперечном сечении и в четверо в объеме.

Рис. 33 Ростовой эффект Akt/PKB: в норме эндокринные β-клетки островков Лангерганса поджелудочной железы отвечают за секрецию инсулина в ответ на повышение уровня глюкозы в крови. (А) Микрофотография нормального островка Лангерганса. (Б) Клетки островка Лангерганса, экспрессирующие конститутивно активную форму Akt/PKB, что вызывает их разрастание до размера, вчетверо превышающего норму.

Помимо Akt/PKB в цитоплазме клеток присутствуют и другие белки, содержащие РН-домены и способные связываться с PIP₃, переходя при этом в активированное состояние. В частности, к таковым относятся белки семейства GEF (guanine nucleotide exchange factors), которые функционируют аналогично Sos и отвечают за активацию малых ГТФаз, отдаленно родственных белкам Ras. Данные ГТФазы принадлежат к семейству сигнальных белков Rho, которое включает в себя собственно белок Rho, а также два родственных ему белка Rac и Cdc42. Подобно Ras, белки семейства Rho действиуют по механизму двойного переключения, попеременно меняя свое состояние с активное (ГТФ-связанное) на неактивное (ГДФ-связанное). После связывания с PIP₃, комплекс Rho-GEFsвоздействует на белки Rhoподобно тому, как Sos воздействует на Ras. В частности, Rho-GEFs индуцирует обмен ГДФ/ГТФ и активацию белков Rho.

Тем не менее, активированные белки Rho выполняют координально отличные от Ras функции. Так, например, данные белки участвуют в перестройке цитоскелета и межклеточных контактов. Действуя таким образом, белки Rho оказывают влияние на форму клеток, их мобильность и, в случае с раковыми клетками, на процессы инвазии. Так, например, белок Cdc42 участвует в реорганизации актиновых филаментов цитоскелета, а также контролирует образование филоподий, в то время как белок Ras принимает участие в формировании ламеллоподий. Таким образом, Rho-ГТФазы играют ключевую роль в процессах, тесно связанных с инвазией и метастазированием.

Во многих типах раковых клеток сигнальные механизмы, включающие метаболиты фосфатидилинозитола и Akt/PKB подвергаются нарушениям не связанным с работой онкобелка Ras (Табл. 3).

Табл. 3 Модификации PI3K-сигналингового механизма в различных видах раковых опухолей человека

Тип рака	Тип модификации
Глиобластома	Мутация PTEN
Карцинома яичников	Мутация PTEN; амплификация Akt2; амплификацияPI3K, мутации PI3K и p85α
Рак молочной железы	Повышение активности Akt1, амплификация Akt2; мутация PTEN
Эндотелиальная карцинома (35%)	Мутация PTEN; метилированиеPTEN
Рак печени	Мутация PTEN
Меланома	Мутация PTEN; метилированиеPTEN
Рак легких	Мутация PTEN
Рак почек	Мутация PTEN
Рак щитовидной железы	Мутация PTEN; повышенная экспрессия Akt/PKB
Лимфоидный рак	Мутация PTEN
Рак простаты (40 – 50%)	Мутация PTEN
Колоректальный рак (>30%)	повышенная экспрессия Akt/PKB; мутации PI3K

В некоторых типах карцином яичников уровень экспрессии PI3Kсущественно повышен. В тоже время, в клетках других опухолей, таких как лимфомы, рак органов головы и шеи, а также колоректальный рак, наблюдается повышенная экспрессия и увеличение активности Akt/PKB.

Увеличение активности PI3K, вызванное мутациями в каталитическом домене р110α, наблюдается примерно в 1/3 случаев колоректального рака. В тоже время, дерегуляция активности Akt/PKB, наблюдаемая во многих типах раковых клеток, чаще всего обусловлена потерей активности PTEN (Табл. 3). Во многих опухолях, таких как рак молочной железы, рак простаты, а также глиобластомы, активность PTEN теряется в результате либо хромосомной мутации, либо в результате метилирования промотора гена PTEN, препятствующего его экспрессии. В целом, исчезновение активности PTEN наблюдается в 30 – 40% случаев всех типов рака. Таким образом, ген PTEN выступает в роли гена-супрессора опухолевого роста.

2.6 Ral-GEF-зависимый сигнальный механизм

Третий важный сигнальный механизм, находящийся под контролем Ras, включает в себя два белка, Ral-A и Ral-B, первичная структура которых на 58% идентична Ras (Рис. 27). Как и в случае белка Ras, процесс активации/инактивации белков Ral включает в себя обмен ГТФ/ГДФ.

Процесс взаимодействия между Ras и Ral осуществляется через посредничество фактора обмена гуаниновыми нуклеотидами (Ral-GEF) который стимулирует высвобождение ГДФ из комплекса с Ral и замещение его на ГТФ, подобно тому, как это происходит между Sos и Ras. Кроме того, в структуре Ral-GEF имеется карман, способный связывать активированный Ras. Это приводит к тому, что, во-первых, Ral-GEF оказывается локализованным вблизи внутренней поверхности плазматической мембраны, а, во-вторых, связывание с Ras приводит к конформационным перестройкам в Ral-GEF, которые приводят к активации обмена гуаниновых нуклеотидов.

Происходящая в итоге активация Ral-A и Ral-B дает им возможность активировать следующие эффекторы сигнального каскада. Так, например, белки Ral могут инактивировать белки семейства Rho, Cdc42 и Rac, о которых уже говорилось выше. Белок Rac способен кроме того подавать митогенетические сигналы и противодействовать эффектам некоторых белков Rho посредством стимуляции продукции активных форм кислорода (АФК). Таким образом, Ral-зависимые механизмы сигнализации, по-видимому, играют важную роль в регуляции клеточной мобильности, которая обусловливает способность раковых клеток к инвазии и метастазированию.

Таким образом, механизмы плейотропного действия онкобелка Ras могут быть рассмотрены на биохимическом уровне, как результат работы трех подконтрольных Ras сигнальных каскадов. Тем не менее, было бы ошибочным полагать, что каждый из эффектов, связанных с работой онкобелка Ras (изменение формы и мобильности клеток, пролиферация, интенсивность анаболических процессов и т.д.) определяется работой только одного из подконтрольных Ras сигнальных механизмов. Напротив, формирование большинства фенотипов, индуцированных Ras, связано с совместной работой нескольких сигнальных каскадов. Кроме того, до сих пор мы рассматривали Ras так, как если бы это был индивидуальный белок. В действительности существует, как минимум, 4 разновидности белков Ras (1 H-Ras, 1 N-Ras и 2 K-Ras), имеющие различную локализацию и функции. Также следует отметить, что список эффекторов Ras, вероятнее всего, не исчерпывается Raf, PI3K и Ral-GEF. Однако другие возможные его партнеры пока мало изучены.

Кроме того, необходимо отметить иерархический характер работы сигнальных каскадов. Так, нарушения, возникающие на верхнем уровне сигнального пути, приводят к гораздо более глобальным изменениям фенотипа клеток, нежели изменения, происходящие в конце каскада. Именно поэтому модификации Ras или предстоящих ему партнеров по передаче сигнала гораздо чаще приводит к неопластической трансформации клеток по сравнению с изменениями, происходящими на нисходящих уровнях сигнализации. Так, например, мутации в гене RAF приводят к формированию мутантной онкогенной аллели BRAF, которая была обнаружена в клетках меланомы человека. В тоже время, трансформирующая активность этой аллели составляет всего 1/5 таковой при замещении остатка глицина на валин в белке Ras.