Результаты контроля пирогенности

№ животного, клетки	Масса животного, кг	Доза, мл	Температура тела животного											Заключение
			Температура тела животного до введения препарата			Температура тела животного после введения препарата
			toCза 30 мин	toC перед введением препарата	toC через 0,5 часа		toC через 1 час	toC через 1,5 часа	toC через2,0 часа	toC через2,5 часа	toC через 3,0 часа	Максимальное повышение ∆toC	Сумма max. повышений ∆toC
4	2,194	1,0	39,1	39,3	39,2		39,2	39,1	39,2	39,2	39,2	0		непирогенен
5	2,445	1,0	39,3	39,2	39,2		39,3	39,3	39,3	39,3	39,2	0,1
6	2,485	1,0	39,1	39,1	39,0		39,2	39,2	39,2	39,2	39,1	0,1

Испытание на стерильность

Испытание на стерильность проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I (ОФС.1.2.4.0003.15).

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по , ТУ 9385-059-05664012-2017 экспериментальная серия.

Испытание на стерильность проводили методом прямого посева.

Посевы инкубировали в течении 14 суток при температуре 32,5 ± 2,5^оС в жидкой тиогликолевой среде и при температуре 22,5 ± 2,5^оС  в среде Сабуро.

Заключение: Исследуемый препарат стерилен.

Протокол определения водородного показателя pH

Потенциометрическое определение pH проведено в соответствии с Государственной Фармакопеей Российской Федерации XIII издание, том I ОФС.1.2.1.0004.15 Ионометрия.

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Измерение проведено на измерителе комбинированном Seven (модификация Seven Easy) в комплекте с электродом, производства Mettler Toledo Inlab Micro № 3221186.

Перед испытаниями была проведена калибровка pH-метра и электрода по трем стандартам буферным растворам, которые охватывают интервал измерений pH данного препарата.

Заключение: значение pH представленного препарата составило 7,2 ед. pH.

Испытания на цитотоксичность

Испытание на цитотоксичность проведено в соответствии с ГОСТ ISO 10993-5-2011 «Изделия медицинские. Оценка биологического действия медицинских изделий. Часть 5. Исследования на цитотоксичность: методы in vitro».

Описание образца: Гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» во флаконах по 3 мл. по ТУ 9385-059-05664012-2017, экспериментальная серия.

Линия клеток: DK-4 штамм диплоидных клеток из кожно-мышечной ткани эмбриона человека получен из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Клетки фибробластоподобные с ядрами овальной формы. Монослойный способ культивирования. Бактерии, грибы, микоплазмы и вирусы в культуре клеток не обнаружены.

Условия культивирования: Клетки выращивали в ростовой питательной среде Игла МЕМ (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) с 10 % сыворотки крови плодов коровы (Gibco, США), 200 мМ L-глютамина, 40 мкг/мл гентамицина в CO2 инкубаторе при 37 ^оС. Посевная концентрация составляла (0,5-1,0)х10⁶ клеток в 1 мл, кратность рассева 1:3, клетки пересевали каждые 3 − 4 суток. Для пересева культур клеток в качестве диспергента применяли 0,25 %-ный раствор трипсина (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) и 0,02 %-ный раствор версена (ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Россия) в соотношении 1:2.

Контроли. В качестве контролей использована ростовая питательная среда с 10 % сыворотки. В качестве препарата сравнения использован «Имплантат для подкожного введения NCTF 135 во флаконах объемом 5 мл» производства Filorga S.A.S. 2-4, rue de Lisbonne 75008 Paris (Франция), Регистрационный номер медицинского изделия ФСЗ 2008/02524, а также препарат «Dermaheal HSR» производства Caregen (республика Корея).

Клеточный ответ оценивали с помощью МТТ-теста. Исследование цитотоксичности препарата проводили с использованием МТТ-теста. Клетки рассевали в 96-луночные культуральные планшеты в концентрации 7 – 10 х10³ клеток/лунка, инкубировали в течение 24 часов при 37^оС в увлажненной атмосфере, содержащей 5% двуокиси углерода (стандартные условия). Посевная концентрация клеток устанавливалась с таким расчетом, чтобы воздействие проходило в экспоненциальной (логарифмической) фазе роста клеток. Далее в планшеты вносили препараты в широком диапазоне концентраций (0,7 – 90%) и совместно культивировали в течение 72 часа при стандартных условиях культивирования. Жизнеспособность клеток оценивали по включению клетками 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н- тетразолиум бромида (МТТ) (Sigma, США) и преобразования его в формазан митохондриальными дегидрогеназами. Для этого в каждую лунку добавляли МТТ-реагент в конечной концентрации 250 мкг/мл, инкубировали клетки в течение 4 часов, затем растворяли образовавшийся формазан 100 мкл ДМСО. Далее снимали значения оптической плотности субстрата в лунках с помощью на микропланшетном фотометре Multiskan FC (Thermo Scientific) при длине волны 492 нм. Процент жизнеспособных клеток вычисляли по формуле: оптическая плотность раствора опыта / оптическая плотность раствора контроля х 100 %. Статистические отличия рассчитывались с помощью критерия Манн-Уитни в программе Statistiсa 8.

Рис.1. Влияние препаратов на жизнеспособность фибробластоподобных клеток человека после совместной инкубации в течение 72 часов.

Заключение: Экспериментально доказано, что гель для внутрикожных инъекций «НЕОКОЛЛ+» не оказывал цитотоксическое влияние на фибробласты человека, напротив показано, что препарат стимулирует пролиферацию клеток в концентрации от 2,8 – 90 % (рис.1). Тогда как, препарат «Dermaheal HSR» (Caregen, республика Корея) значительно снижал жизнеспособность фибробластоподобных клеток человека в дозе от 11,25 – 90 % процент жизнеспособных клеток снизился до 40 %.