2.2 Зерттеуді жүргізу әдістері

2.2.1Триптофан өндірісі және алу әдістері

Триптофанның химиялық синтезі. Индол Манниха әдісі бойынша формальдегипен және диметиламинді аминометилдейді. Алынған 3-диметиламинометил-индолды нитросірке қышқылының метил эфирімен конденсациялайды, ол 3-индолилнитропропион қышқылының метилатының түзілуіне әкеледі. Содан соң нитротопты амин топқа дейін тотықсыздандырады. Осы жасалған үрдістерден соң яғний эфирді сілтімен гидролиздегеннен соң D/L-триптофанның натрий тұзы түріндегі формасы алынады [22]. Химиялық синтез жолымен алынған триптофанның құрамында уытты заттар қоспалар қосылыстары болатындығы анықталған. Синтетикалық триптофанды мал азықтарының жемдік тағамдарына қосады.

Химиялық – ферментативті синтез

Микроорганизімдердің, яғни соның ішінде Escherichia coli, пиридоксаль тәуелді фермент триптофан-индол-лиаза (триптофаназа КФ 4.1.99.1, гена tnaA гнінің өнімі) белгілі. Бұл ферменттің атқаратын қызметі тепе-теңдікті қадағалау үшін және реакцияның толық қанды жүруіне қажет жағдай жасайтындығымен белгілі

триптофан + су ⇋ индол + пируват + аммоний.

Осы жағдайлардың арқасында триптофанды индол, пировинограднды қышқыл және аммиакты ферментативті конденсациялу арқылы алуға болады.

Микробиологиялық синтез

Көп жағдайда L-триптофанның өенркәсіптік өндірісінде Candida utilis ашытқылар штамптарын пайдаланады, дефектті aro-гендер бойынша және фенилаланинді және тирозинді ауксотрофты нәтижесіндегі жолмен синитезделеді. Синтез үшін бастапқы шикі заттр ретінде көп жағдайда салыстырмалы түрде арзан синтетикалық антранилді қышқыл қолданылады, оны қолдануды бір-қатар мақсатты жағдайлар үшін бірнеше себептері бар. Біріндіден ол үрдісті жинақы етеді және арзан болуын қамтамасыз етеді, ал екіншіден жүретін механизімдерді үнемі қадағалауға мүмкіндік береді (алынатын (целевой) өнім триптофан антранилатсинтазаға ингибирлеуші әсер береді). Аз мөлшерлі және қосымша регуляторлық эффектер тудырмайтын фенилаланин және тирозиннің мөлшері қатысында Candida utilis мутанттары антранилді қышқылының L-триптофанға өтуінің культуралды ортасынна енуіне жағдай жасайды.

Триптофанның микробиологиялық өндірісінде бастапқы шикізат ретінде сонымен қатар синтетикалық индол да қолданылады. Үрдіс триптофан-синтетазаның белсенділігіне және сериннің қолжетімділігіне тәуелді 23.

Азықтық триптофанның көздері

Триптофан азықтық ақуыздардың компоненті болып табылады. Триптофанға бай азық түлік өнімдері болып сыр, балық, ет, боботы, сүзбе, саңырауқұлақтар, сұлы, кептірілген финики, жаңғақ, кунжут, кедр жаңғағы, сүт т.б.

Триптофан көптеген өсімдік құрамында да кездеседі, оның мөлшері көп болатындары соялы бұршақтар. Өте аз мөлшерде триптофан жүгіеріде болады, соған байланысты тек осы затпен азықтану триптофанның жетіспеушілігіне әкеліп соғады және пеллагрегияға алып келеді. Триптофанға бай келетін тағамдық заттар ішінде жаңғақ болып табылады, оны жаңғақ майы деп те атайды.

Ет және балық тағамдарында да триптофан кездеседі, олардың мөлшері әрқайсысының түріне қарай өзгереді байланыстырушы ұлпа ақуыздарында триптофан болмайды (коллоген, эластин, желатин) [24].

Кесте 4 - Триптофанның заттардағы мөлшері

№ р/н	Өнім	100 г-дағы мг	№ р/н	Өнім	100 г-дағы мг
1	Бұршақ, фасоль	260	16	Сиыр еті I категории	210
2	Бидай ұны (1- сорт)	120	17	Сиыр еті II категории	230
3	Крупа гречневая	180	18	Қой еті	200
4	Күріш	80	19	Қоян еті	330
5	Тары	180	20	Колбаса	160
6	Сұлы ұнтағы	160	25	Палтус, судак	180

Триптофанды алу үшін химико – ферментативті әдіс индолдың, аммиактың және пирожүзім қышқылының тікелей конденсациянан тұрады:

Фермент табиғатта кеңінен таралған E.coli бактериясында табылады және субстраттың ерекшелігімен кеңінен сипатталады. L – триптофаннан басқа оның субстратымен L – цистеин, 8-метил – цистеин, хлор-L – аланин, L-серин саналады. Триптофанды қосқаннан ферменттің пайда болуы индуцирленеді, ал индолды қосқанда бактерияда оның синтезі ингибирленеді, сондықтан, триптофан алу процесінде аммиакпен, пируваттың артық мөлшері болады.

Химико – энзиматикалық әдісті қолданумен триптофан алуда амин қышқылының шығымы 63 г/л құрайды.

Тармақталған метаболиттік жолмен лизин, триптофан пайда болады, сондықтан осы өндіріс үшін оларда блокирленген реакция фенилаланиннің және тирозиннің синтезделуіне әкелетін ауксотрофты мутанттарды қолданады. Микроорганизмнің бірқатар басқа ароматты амин қышқылымен (тікелей көптеген микроорганизмде) эритрозо – 4 – фосфат және фосфенолпируват көмірсудың ауысуымен метаболитпен алынады. Триптофанның метаболиттік предшественнигі болып, антранилат синтетазасының әсерінен хоризм қышқылынан пайда болатын антранилді қышқыл атқарады. Антранилатсинтетазаға триптофан ингибирлеуші әсер етеді, сондықтан фермент синтезіне метаболиттік бақылау жасау үшін предшественник антранил қышқылдарын (0,1-0,3%) индуцирлейтінді сатылап енгізу қажет (сурет 4).

Сурет 4 – Триптофан синтезі

Осыған байланысты триптофан өнірісінің ерекшелігі екі сатылы сызба – нұсқа бойынша ұйымдастырылған. Бірінші сатыда химиялық әдіспен антранилді қышқылды синтездеу, мутантты штамм ашытқысы Candida utilis энзиматикалық жүйелердің көмегімен триптофанның пайда болуына әкеледі.

Ашытқы биомассасы 30°С температурада минерал компонентті және мочевина қызылша мелассасын құрайтын ортада өсіріледі. Бір тәулік өткен соң ферментерге 5 % антранил қышқылының спирт ерітіндісін және 50% мочевина ерітіндісін қосады, ал предшественикті қосқаннан кейін 3-4 сағат өткен соң көміртегі көзін (25% меласса ерітіндісін) қосады. Антранил қышқылын және мочевинаны 6 сағат өткен соң жібереді, ал мелассаны 12 сағат өткен соң жібереді.

Екі сатылы ферментация процесі 144 сағаттан кейін аяқталады және культуральды сұйықтықтағы триптофанның құрамы 6г/л құрайды.

Триптофаннан басқа микробиологиялық әдіспен алғашқы заттарды қолданып гистидин, изолейцин, метионин, серин және треонин алады. Ауксотрофты мутантты бактерия Bacillius subtilis негізінде триптофанды алудың бір сатылы технологиясы кең таралмаған, лизин алу әдісіне жақын. Бір сатылы процестің ұзақтығы 48-сағат, культуральды сұйықтықта триптофан концентрациясы 10г/л құрайды. Культуральды сұйықтықты кептіргеннен кейін азықтық концентрат триптофан алынады, онда ақуыз, бос триптофан, В_1, В₂ и РР витаминдер қосылған.

Тазалығы жоғары триптофанның кристалды препараты культуральды сұйықтықты хроматографиялық бағанада ионалмасу әдісімен қосымша тазартылғаннан кейін пайда болады, толтырылған катионит (сорбция, рН 1,0; элюация 5% гидроксид аммоний ерітіндісі пропанол қоспасымен) болады. Элюаттар кристаллизацияланады; кристалдар жуылады және кептіріледі. Триптофан препараты кристал түрінде 99 % дейін жетеді.