1. Индукция каллуса. Морфогенез в культуре тканей растений.

Исследовано влияние гормонального состава питательной среды, времени введения эксплантов в культуру in vitro и типа экспланта (лист, стебель, черешок) на индукцию каллусогенеза в культуре изолированных органов у душицы обыкновенной (Origanum vulgare L.). Определен оптимальный режим получения асептических культур из семян, сегментов листа, стебля и черешка последовательная обработка 70 %-ным этанолом (1 мин) и 50 %-ным «Брадофеном» (4 мин). Показано, что максимальная частота каллусогенеза (до 85 %) наблюдалась при использовании среды Мурасиге и Скуга, дополненной 1,0 мг/л 2,4-Д и 0,5 мг/л 6-БАП. На большинстве испытанных сред частота каллусогенеза выше при культивировании сегментов черешка листа по сравнению с эксплантами листа и стебля. Установлено, что при помещении на питательные среды эксплантов в весенний и зимний периоды частота каллусогенеза была в 2-4 раза больше по сравнению с летним.

Существует несколько путей, по которым может пойти каллусная клетка после ее дедифференцировки: 1) вторичная регенерация целого растения, возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, органов; 2) утрата способности к вторичной дифференцировке и регенерации растений, стойкая дедифференцировка, приобретение способности расти без гормонов - опухолевая (это явление чаще наблюдается у старых культур); 3) нормальный онтогенез каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и умиранием. Клетка претерпевает вторичную дифференцировку и прекращает делиться (стационарная фаза). Интереснее регенерация. В культуре каллусных тканей морфогенезом называют возникновение организованных структур из неорганизованной массы клеток. Существуют различные типы морфогенеза: органогенез - корневой, стеблевой, флоральный, листовой; соматический эмбриогенез (образование зародышеподобных структур из соматических клеток). В случае органогенеза сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже из них - целые растения, исключение - корневой органогенез . В отличие от органогенеза при соматическом эмбриогенезе сразу образуется биполярная структура (соматический зародыш), имеющая зачаточный корешок и стеблевую почку, из которой развивается растение.

Тотипотентность - это способность любой клетки воспроизвести целое растение. Любая растительная клетка содержит весь набор генов и сохраняет свойственную зиготе программу развития любого органа: лист, лепесток, сердцевинная паренхима и т.п. Однако возможности разных типов клеток различны, свойство тотипотентности не всегда реализуется. В некоторых клетках гены в сильной степени репрессированы. В организме тотипотентность не проявляется, так как организм подавляет потенциал развития отдельной клетки, изоляция способствует проявлению этих потенций. Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка. Регенерация растений начинается с вторичной дедифференцировки. При этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции специализированных. Большая роль в этом процессе принадлежит фитогормонам. Они вызывают изменение метаболизма клеток. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда заканчивается морфогенезоим и регенерацией растений. Иногда это гистодифференцировка. Таким путем клетка каллуса может превращаться во флоэмные и ксилемные элементы, из активной клетки в старую. Для управления морфогенезом используются внешние и внутренние факторы: внутренние - вид растения, генотип, орган, из которого взят эксплант; внешние - состав питательной среды, температура, свет (интенсивность, спектр, длина фотопериода).

Сигналом (импульсом) морфогенеза является изменение соотношения цитокининов и ауксинов, т.е. они не только регуляторы роста, но и дифференцировки. Эмбриогенез фактически не зависит от гормонов. Обычно эмбриогенные зоны возникают в каллусной ткани на той же питательной среде, на которой шло каллусообразование. Развитие соматических зародышей в каллус-ной ткани начинается тогда, когда устраняется дедифференцирующий фактор из питательной среды. Развивающийся зародыш не нуждается в экзогенных гормонах. Дополнительные стимулы морфогенеза - азотнокислое серебро, нитрат аммония, некоторые аминокислоты (пролин, тирозин, иногда серин), полиамины (путресцин и спермидин). В ряде случаев стимулируют морфогенез маннит и сорбит. Ионы окиси азота влияют на развитие возникающих в каллусной ткани организованных структур, а их индукцию стимулируют ионы аммония - NH4. Гибберелловая кислота способствует росту зачатков стебля, а абсцизовая - ускоряет дифференциацию органов соматических зародышей. Азотнокислое серебро продлевает регенерационную способность в старых пересадочных культурах. Лишь одна из 400-1 000 клеток регенерирует. Одного стимула недостаточно, необходима еще готовность к нему. Способность воспринимать стимулы морфогенеза определяется как компетентность клетки.

2. Получение соматических гибридов методом слияния изолированных протопластов. Для применения методов соматической гибридизации необходима разработка соответствующих технологий получения протопластов, способных делиться и регенерировать растения. Выделение протопластов растительных клеток путем их плазмолизирования и механического разрушения клеточной стенки было осуществлено еще в конце прошлого века. Однако метод изолированных протопластов получил развитие лишь после того, как в 1960 г. И. К. Коккинг впервые осуществил ферментативное разрушение клеточной стенки и выделил голые протопласты. В настоящее время продолжается разработка и совершенствование методов выделения и культивирования протопластов на искусственных питательных средах. Для культивирования протопластов применяют те же питательные среды, что и для культуры изолированных клеток и тканей. Отличительной чертой сред для протопластов является повышенное осмотическое давление на начальных этапах культивирования, которое обеспечивается высокой концентрацией маннита или СаС12. В процессе культивирования изолированные протопласты регенерируют новую клеточную стенку и превращаются в клетки, способные делиться и давать начало образованию каллусной ткани. На формирование колоний протопластами влияет состав питательной среды. Дальнейшая задача – получение из каллусной ткани растений-реге-нерантов. Пока не удалось получить регенеранты из протопластов многих злаковых (пшеницы, ячменя). Однако успешно осуществляется регенерация из протопластов пасленовых (табак, картофель, томаты) и других культур. Протопласты выделяют из каллусных, суспензионных клеток или из клеток листьев, меристем, стеблей. При выделении протопластов из листьев сначала удаляют эпидермис, лист нарезают на сегменты и затем подвергают энзиматической обработке пектиназой и целлюлозой. Слияние изолированных протопластов может происходить спонтанно, но довольно редко. Индуцированное слияние изолированных протопластов впервые было получено в лаборатории Коккинга в 1970 г. его сотрудниками Пауэром и др. В качестве индуктора они использовали нитрат натрия. Но этот метод оказался малоэффективным, и сейчас найдены другие фьюзогены (индукторы слияния). Наиболее эффективными из них оказались растворы с высоким рН (9–11) и высокой концентрацией ионов кальция (100–300 мМ). Протопласты предварительно агглютинируют с помощью концентрированных растворов полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1500–6000. У. Циммерман с сотрудниками. разработали физический метод слияния протопластов животных клеток, липосом, в котором в качестве индуктора использовались импульсы электрического тока. Слияние протопластов приводит к образованию либо гибрида, либо цибрида. Цибридная клетка содержит цитоплазму обоих партнеров, а ядро – одного. Это возможно в том случае, если после слияния протопластов не происходит соединения ядер, и одно ядро дегенерирует. Образование цибрида возможно и в том случае, если один из протопластов лишен ядра или оно инактивировано путем облучения. Цибридизация позволяет ввести цитоплазматические гены, несущие признаки ЦМС (цитоплазматической мужской стерильности), устойчивости к некоторым гербицидам и патогенам. Первый неполовой межвидовой гибрид высших растений получен в 1972 г. путем слияния изолированных протопластов двух видов табака: Nicotiana glauca и N. Langsdorfii. В настоящее время методом парасексуальной гибридизации получено большое число межвидовых, межсемейственных и межтрибных гибридов. Однако во многих случаях гибридные растения, полученные таким путем, в той или иной степени ненормальны. Примером может служить соматический гибрид между арабидопсисом и турнепсом, который является растением- монстром. Возникающие аномалии являются результатом хромосомной несбалансированности. Особый интерес представляют межцарственные клеточные гибриды, полученные от слияния протопластов растительных и животных клеток. Описаны гибриды между протопластами эритроцитов крысы и протопластами дрожжевых клеток, между протопластами моркови и человека, табака и человека и др. При соматической гибридизации эксперимент строится аналогично опытам по генетике микроорганизмов. Иными словами, используются большие популяции клеток обоих родителей. При обработке смешанной суспензии протопластов фьюзогенами часть из них сливается друг с другом, но в суспензии остаются и неслившиеся протопласты. Все они, включая гибридные, вдальнейшем регенерируют клеточные стенки и переходят к делениям. Возникает задача – выделить из общей массы гибридные экземпляры. Селекция гибридов может применяться либо на клеточном уровне, либо на стадии регенерации и осуществляется несколькими методами. Для идентификации гибридов могут служить пластиды. Например, при слиянии протопластов табака и моркови в качестве селективных маркеров использовались зеленые хлоропласты табака и красно-оранжевые хромопласты моркови. Другим методом, позволяющим производить отбор гибридов, является генетическая комплементация. Этот метод был применен для обнаружения гибридов табака, при этом использовались хлорофиллдефектные мутации у родителей с последующей комплементацией в гибридных продуктах. Сочетание двух ядерных рецессивных мутаций у табака вызывает светоза- висимую хлорофилльную недостаточность. Растения, гомозиготные по любому из этих генов, выращиваемые при интенсивном освещении, обесцвечиваются и гибнут. После слияния и регенерации клеточные колонии пересаживают на среду, индуцирующую стеблевой органогенез, и культивируют на свету. Под методом физиологической комплементации, который также используется для обнаружения соматических гибридов, подразумевают способность гибридных клеток жить и размножаться либо переходить к морфогенезу в условиях культуры, при которых родительские клетки этого делать не в состоянии, причем неспособность родительских клеток не связана с какой-нибудь определенной мутацией, а является нормальной физиологической реакцией клетки на физиологические условия. Например, половые гибриды между N. glauca и N. Langsdorfii имеют склонность к опухолеобразованию, а клетки гибридов в условиях in vitro способны расти и размножаться на питательных средах без гормонов. Гормононезависимость клеток гибрида и была положена в основу метода селекции. После индуцированного слияния протопластов из мезофилла листьев обоих видов табака клетки через некоторое время пересаживали на питательную среду, не содержащую фитогормонов, и отбирали колонии, способные расти в этих условиях. Существуют также другие методы селекции соматических гибридов: смешанная физиологогенетическая комплементация, физическое обогащение (метод основан на разделении протопластов при центрифугировании в связи с их различной плотностью), механическая изоляция. Использование изолированных протопластов в селекции растений не ограничивается возможностью их индуцированного слияния и получения соматических гибридов. Изолированные протопласты способны поглощать из окружающей среды макромолекулы и органеллы, следовательно, в них можно вводить чужеродную информацию, не пересаживая ДНК или органеллы других клеток. Уже проведена успешная трансплантация изолированных ядер в протопласты петунии и табака. Вместе с тем поглощение протопластами чужеродных ядер не всегда ведет к образованию гибридов. Кроме ядер в изолированные протопласты удалось трансплантировать чужеродные хлоропласты. Из этих протопластов Карлсон получил растения- регенеранты, содержащие хлоропласты другого организма. Однако работы по переносу чужеродных органелл и ДНК только начинают развиваться. В целом использование изолированных протопластов в генетической реконструкции клетки, как мы видим, открывает богатые перспективы перед клеточной селекцией