Вопрос 63 Иммуноферментный анализ. Фармакологические пробы при идентификации некоторых алкалоидов (атропин, никотин, стрихнин).
Иммуноферментный анализ позволяет за минимальное время из достаточно большого круга исследуемых соединений выявить одно или несколько веществ.
Особенность метода: нет необходимости проводить изолирование веществ из объекта и применять специальные приемы по их очистке.
В основе – взаимодействие специфических белковых антител (антисывороток) с анализируемым веществом, выступающим в роли антигена (гаптена). Чем больше конц. в объекте вещества-антигена, тем больше образуется комплекса антиген-антитело. Чтобы детектировать получаемый результат, один из компонентов реакции – гаптен или антитело метят специальной меткой.
Этапы иммуноферментного анализа:
1 этап. Нанесение метки на препарат или его аналог.
2 этап. Добавление антисыворотки с антителами и образование комплекса антителомеченый препарат.
3 этап. Добавление исследуемой крови (сыворотки) или мочи. Происходит вытеснение анализируемым веществом меченого препарата из комплекса и образование нового комплекса: анализируемое вещество-антитело.
4 этап. Измерение радиоактивности, интенсивности флуоресценции, активности фермента и т.д.
Виды:
Анализ гомогенный, в котором все компоненты находятся в растворе;
Анализ гетерогенный, в котором реагирующие компоненты разделяют путем включения стадии «отмывки» или центрифугирования
1. Гомогенный иммуноферментный анализ (ИФА) используется для предварительного установления факта употребления одурманивающих средств.
Используемые в анализе антитела – Ig, продуцируемые лимфоцитами животных (мелкого и крупного рогатого скота) при введении им инородных веществ
В гомогенном ИФА в качестве метки используют оксидазы (они способны окислять хромогенный субстрат (специальное химическое вещество, например хлорнафтол) с образованием окрашенного соединения)
2. Гетерогенный иммуноанализ. В качестве метки в этом варианте иммунохимического метода используют ферменты пероксидазу, р-галактозидазу, фосфатазу и др.
Метод заключается в том, что препарат (антиген) реагирует с избытком
фермент-меченых антител. После образования комплекса антиген-антитело избыток антител связывают добавлением специфического твердофазного иммуносорбента и удаляют отмыванием или центрифугированием.
Затем добавляют хромогенный субстрат, кот. взаимодействует с фермент-меткой, связанной с антителом, закрепленным на тверд. носителе, и образует соответств. окраску.
Если конц. определяемого вещества в пробе будет значительно превышать конц. гаптена, меченого ферментом, то после удаления последнего из реакционной смеси (при отмывании или центрифугировании) хромогенный субстрат не образует окраски (положительный результат анализа).
При возникновении окраски результат анализа отрицательный.
Фармакологические пробы при идентификации некоторых алкалоидов:
Такие испытания проводятся на некоторые ядовитые в-ва, которые при воздействии на организм животных вызывают характерные физиологические реакции
Выделенные из объекта алкалоиды хорошо очищают с помощью соответствующих методов (о них мы говорили ранее) и испытывают на животных.
Атропин, кокаин при введении в глаз кошки вызывают расширение зрачка
При нанесении очищенного экстракта из объекта, содержащего никотин, вератрин, на спинку лягушки она принимает характерную позу
Нанесении на спинку лягушки экстракта из объекта, содержащего стрихнин, появляются тетанические судороги сначала от прикосновения к лапкам, затем при сотрясении или ударе. Наконец лягушка вытягивается и погибает в характерной позе