Подготовка объектов к изолированию ядовитых веществ:

Внутренние органы (печень, почки, мышечная ткань). 

1. Измельчение до размеров кусочков 0,5 x 0,5 x 0,5 см. Более мелкое измельчение приводит к увеличению экстракционной поверхности и одновременно к значительному увеличению количества балластных эндогенных соединений (белков, ферментов, продуктов распада белковых молекул, пигментов и др.) в извлечении, что потребует особых способов очистки и приведет к потере токс. в-в, особенно при их следовых количествах в объекте.

2. Вымораживание объекта при температуре -30-40°С.

При этом в органах образуются льдинки, которые разрывают клетки, ткани и способствуют выходу токсических веществ в окружающую среду, что увеличивает процент изолирования искомых соединений.

3. Лиофилизация, т.е. высушивание объекта при низких Т в вакууме. Приводит к потере объектом воды и получению при изолировании более чистых извлечений.

• Если объект законсервирован спиртом, его осторожно удаляют.

• В случае подозрения на отравление летучими соединениями мышьяка, ртути объект подщелачивают перед удалением спирта карбонатом натрия.

4. Кровь. Ядовитые вещества и их метаболиты в крови находятся в свободном виде или могут быть связаны с белками (альбуминами, глобулинами). При пробоподготовке крови к экстракции используют приемы, позволяющие разрушить комплекс анализируемого вещества с белком:

Добавление к крови смешивающихся с водой орг. р-лей (этилового, метилового спиртов, ацетонитрила, ацетона). Их кол-во 10 раз превышает объем крови. В результате под влиянием ацетона и спиртов (этилового и метилового) происходит агрегация молекул белковых веществ крови, понижается р-римость и происходит выпадение их в осадок.

Добавление химических агентов для коагуляции белков: кислот (трихлоруксусной,

хлорной), солей тяжелых металлов (например, солей бария).

Термическая обработка крови (для ядовитых веществ, которые не разлагаются

при повышенной температуре).

Процесс пробоподготовки крови к анализу - весьма ответственная операция, при которой возникает опасность адсорбции значительного количества анализируемого вещества на скоагулироваином белке.

5. Моча. С мочой токс. в-ва выделяются как в неизмененном состоянии, так и в виде метаболитов и конъюгатов с сериой, уксусной, глюкуроновой кислотами.

Пробоподготовка мочи к экстракции токс. веществ и их метаболитов включает проведение разрушения конъюгатов с указанными кислотами.

Для этой цели проводят гидролиз:

• Неспецифический кислотный гидролиз является более быстрым и простым в

осуществлении. Но вследствие неспецифичности реакции расщепления ковалентной связи и жестких усло­вий проведения в среде конц. кислоты при кипячении в течение длительного времени или при нагревании в автоклаве под давлением, образуется большое кол-во побочных продуктов. Экстракция орг. р-лем из полученного гидролизата дает высокий фон и много посторонних пиков при проведении анализа ме­тодом газовой хроматографии.

Кислотный гидролиз проводится в герметично закрытых сосудах, которые помещают в водяные бани или специальные нагревательные блоки. Можно использовать кипячение с обратным холодильником или нагревание при 100- 125°С в автоклаве под давлением 12-15 пси.

ВОЗ для опиатов рекомендуется про­водить кислотный гидролиз по следующей методике: в пробирку емкостью 50 мл вносят 10 мл мочи, добавляют 1 мл концентрированной HCl, герметично закрывают пробирку и нагревают в водяной бане при 100°С около 60 мин. После охлаждения проводят экстракцию органическим растворителем.

• Ферментативный гидролиз проводится в присутствии одного или смеси

ферментов β-сульфатазы и β-глюкуронидазы в мягких условиях, что уменьшает образование по­бочных продуктов, и гидролизат получается более чистым.

Существенным недостатком метода явл. необходимость соблюдения строгих условий гидролиза: pH, температу­ры, состава буфера, активности ферментов, – а также длительность процесса (12-20ч). Легче гидролизуются конъюгаты, образованные через кислород фенольного гидроксила, более длительно – конъюгаты, связанные через кислород гидроксильной группы.

Методика, рекомендованная ВОЗ для ферментативного гидролиза опиатов: в 5-10 мл мочи создают рН=7 с помощью уксусной кислоты, затем добавляют 0,1 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора с рН=5,5 и 0,02 мл фермента (75 ЕД/мл) на каждый мл мочи. Смесь оставляют на 24 ч при 37°С или иа 1 ч при 55°С. Температура не должна превышать 55°С, иначе фермент может подвергнуться денатура­ции. После охлаждения проводят экстракцию органическим растворителем.

6. Слюна. Для снижения активности ферментов слюну при хранении замораживают. Перед экстракцией ее разбавляют водой очищенной в отношении 1:3, после чего экстрагируют токс. вещества орг. р-лями при соответствующем значении pH.

7. Волосы, ногти. Для удаления внешних загрязнений волосы и ногти отмывают 2М раствором HCl и метанолом (или этанолом), затем сушат при ком­натной температуре и отбирают для анализа навеску 30-40 мг.