Volume1

238 Часть 1. Введение в мир клетки

Рис.3.42.Какнековалентныесвязиопосредуютвзаимодействиемеждумакромолекулами.

лиганда будет врезаться в участок связывания на антителе и будет образовываться комплекс антитело–лиганд. Так что популяция комплексов антитело–лиганд будет расти, но не беспредельно: через какое-то время начнет превалировать второй процесс, в ходе которого отдельные комплексы будут распадаться из-за теплового движения. В конечном счете всякая популяция молекул антитела и лиганда достигнет устойчивого состояния, или равновесия, при котором число событий ассоциации в секунду в точности равно числу событий диссоциации (см. рис. 2.52).

По известным концентрациям лиганда, антитела и комплекса антитело–лиганд в состоянии равновесия мы можем рассчитать параметр, который позволяет оценить силу связывания антитела с лигандом, — константу равновесия (K) (рис. 3.43, а). Константа равновесия реакции, в которой две молекулы (А и B) связываются друг с другом с образованием комплекса (AB), выражается в единицах литр/моль

иозначает, что половина участков связывания будет занята лигандом, когда концентрация этого лиганда (в моль/литр) достигнет значения, равного 1/K. Определенная таким образом константа равновесия тем больше, чем больше сила связывания, и служит прямой мерой разности свободной энергии между связанным

исвободным состояниями системы (рис. 3.43, б и в). Изменение даже нескольких нековалентных связей может оказать значительное влияние на взаимодействие, как показано в примере на рис. 3.44. (Следует иметь в виду, что константа равновесия, соответствующая данному нами определению, известна также как константа

аффинности, или константа сродства, Ka.)

Мы обратились к случаю связывания антитела со своим лигандом, дабы проиллюстрировать влияние силы связывания на константу равновесия, но те же самые принципы относятся к любой другой молекуле и ее лиганду. Многие белки являются ферментами, которые, как мы теперь говорим, сначала связываются со своими лигандами, а затем катализируют разрыв или образование ковалентных связей в этих молекулах.

3.2.7.  Ферменты — высокоспецифичные катализаторы

Многим белкам для исполнения предписанных им ролей достаточно просто связаться с некоторой другой молекулой. Например, молекуле актина необходимо всего лишь объединиться с другими молекулами актина, чтобы образовать филамент.

Глава 3. Белки 239

Рис.3.43.Взаимосвязьэнергиисвязииконстантыравновесиядляреакцииассоциации.а)Равновесие между молекулами А и B и комплексом AB поддерживается балансом двух взаимно обратимых реакций, представленных на панелях 1 и 2. Молекулы А и B, чтобы прореагировать друг с другом, должны столкнуться, и поэтому скорость их ассоциации пропорциональна произведению их концентраций [А]·[B]. (Квадратные скобки обозначают концентрацию.) Как показано на панели 3, отношение констант скорости для реакций ассоциации и диссоциации равно константе равновесия (K) этой реакции. б) Константа равновесия на панели 3 относится к реакции А + B ↔ AB, и чем больше ее величина, тем сильнее связывание между А и B. Обратите внимание, что на каждые 1,41 ккал/моль (5,91 кДж/моль) уменьшениясвободнойэнергииконстантаравновесиявозрастаетв10раз(при37°C).

Вданномслучаеконстантаравновесиявыраженавединицахлитр/моль:дляпростыхвзаимодействий по типу связывания ее называют также константой сродства, или константой афинности, и обозначаютKa.ОбратнуюейвеличинуназываютконстантойдиссоциацииKd (вединицахмоль/литр).

242 Часть 1. Введение в мир клетки

может обработать молекулу субстрата. Эта максимальная скорость, поделенная на концентрацию фермента, носит название числа оборотов. Число оборотов часто равно приблизительно 1 000 молекул субстрата в секунду, обрабатываемых одной молекулой фермента, хотя известны и другие значения — от 1 до 10 000.

Другой кинетический параметр, часто используемый для характеристики фермента, — это Km — концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине ее максимальной скорости (0,5 Vmax) (см. рис. 3.45). Низкое значение Km означает, что фермент достигает максимальной каталитической скорости при низкой концентрации субстрата, и обычно указывает на то, что этот фермент связывается со своим субстратом очень сильно, тогда как высокое значение Km соответствует слабому связыванию3. Методы, применяемые для характеристики ферментов подобным образом, расписаны в приложении 3.3 (стр. 244–245).

3.2.9.  Ферменты ускоряют реакции за счет избирательной стабилизации переходных состояний

Ферменты достигают чрезвычайно высоких скоростей химических реакций — скоростей, которые намного выше, чем у синтетических катализаторов. Есть несколько причин такой эффективности. Во-первых, фермент увеличивает локальную концентрацию молекул субстрата на каталитическом участке и удерживает все необходимые атомы в правильной для протекания намеченной реакции ориентации. Но что еще важнее, часть энергии связывания вносит прямой вклад в катализ. Молекулы субстрата должны пройти через ряд промежуточных состояний со своей слегка изменяющейся геометрией и своим распределением электронов, прежде чем из них образуются конечные продукты реакции. Свободную энергию, необходимую для достижения наиболее неустойчивого переходного состояния, называют энергией активации этой реакции, и это главная определяющая скорости реакции. Ферменты обладают намного более высоким сродством к переходному состоянию субстрата, чем к его устойчивой форме. Поскольку это сильное связывание значительно снижает энергию переходного состояния, фермент намного ускоряет определенную реакцию, понижая ее энергию активации (рис. 3.46).

Целенаправленно получая антитела, которые действуют подобно ферментам, мы можем продемонстрировать, что стабилизация переходного состояния может во много раз увеличить скорость реакции. Рассмотрим, например, гидролиз амидной связи, которая аналогична пептидной связи, соединяющей две соседние аминокислоты в белке. В водном растворе амидная связь очень медленно гидролизуется по механизму, показанному на рис. 3.47, а. В расположенном в центре промежуточном продукте, или переходном состоянии, карбонильный углерод связан с четырьмя атомами, находящимися в вершинах тетраэдра. Производя моноклональные антитела, которые прочно связываются с устойчивым аналогом этого очень неустойчивого

тетраэдрического промежуточного продукта, можно получить антитело, которое действует подобно ферменту (рис. 3.47, б). Поскольку такое каталитическое анти- тело связывается с тетраэдрическим промежуточным продуктом и стабилизирует его, оно увеличивает скорость самопроизвольного гидролиза амидной связи более чем в 10 000 раз.

3 Строго говоря, низкое значение Km означает, что фермент катализирует превращение данного субстрата быстро, тогда как высокое значение Km соответствует медленному каталитическому процессу. Иногда просто говорят «быстрая» и «медленная» реакция. — Прим. ред.

Глава 3. Белки 243

Рис.3.46.Ферментативноеускорениехимических реакцийпутемсниженияэнергииактивации.Ча-

стооказываетсятак,чтоинекатализируемаяреакцияАикатализируемаяферментомреакцияBмогут проходитьчерезнесколькопереходныхсостояний. Именнопереходноесостояниеснаиболеевысокой энергией(STиEST)определяетэнергиюактивациии лимитируетскоростьреакции.(S=субстрат;P=продукт реакции; ES = комплекс фермент–субстрат; EP=комплексфермент–продукт.)

Рис.3.47.Каталитическиеантитела.Стабилизируяпереходноесостояние,антителостановитсяферментом.а)Входереакциигидролизаамиднойсвязиобразуетсятетраэдрическийпромежуточныйпродукт, соответствующий в реакции переходному состоянию с высокой энергией. б) Молекула слева была ковалентносвязанасбелкомииспользованавкачествеантигенадлясозданияантитела,котороепрочно связывается с областью молекулы, показанной желтым. Поскольку это антитело прочно связывается такжеиспереходнымсостояниемнавидеа,оно,какоказалось,обладаетдействиемфермента,который эффективнокатализируетгидролизамиднойсвязивмолекуле,изображеннойсправа.

246 Часть 1. Введение в мир клетки

3.2.10.  Ферменты могут одновременно использовать кислотный и основный катализ

На рис. 3.48 приведено сравнение скоростей самопроизвольно протекающих реакций со скоростями катализируемых соответствующим ферментом реакций – по пяти ферментам. Степени увеличения скорости изменяются от 109 до 1023. Ясно, что ферменты являются намного более совершенными катализаторами, нежели каталитические антитела. Ферменты не только прочно связываются с переходным состоянием, они также содержат точно размещенные атомы, которые изменяют электронные распределения в тех атомах, которые непосредственно участвуют в создании и разрушении ковалентных связей. Пептидные связи, например, можно гидролизовать и при отсутствии фермента, подвергая полипептид действию сильной кислоты или сильного основания, как показано на рис. 3.49. Однако в отношении способности одновременно использовать кислотный и основный катализ ферменты уникальны, так как жесткий полипептидный остов связывает кислотные и оснóвные остатки и препятствует их объединению друг с другом (что они сделали бы в рас-

творе) (рис. 3.49, г).

Рис.3.48.Ускорениереакцийферментами.(ПереработаноизA. RadzickaandR. Wolfenden,Science267:

90–93,1995.СлюбезногоразрешенияиздательстваAAAS.)

Соответствие между ферментом и его субстратом должно быть абсолютно точным. Небольшое изменение, привнесенное посредством генной инженерии

вактивный участок фермента, может оказать сильное воздействие. Например,

водном ферменте замена глутаминовой кислоты аспарагиновой кислотой смещает положение каталитического карбоксильного иона всего лишь на 1 Å (то есть примерно на один радиус атома водорода); и все же этого достаточно, чтобы снизить активность фермента в тысячу раз.

3.2.11.  Лизоцим работает как типичный фермент

Чтобы наглядно показать, как ферменты катализируют химические реакции, мы рассмотрим фермент, который служит природным антибиотиком в яичном белке,

Глава 3. Белки 247

Рис. 3.49. Кислотный и основный катализ. а) Начало некатализируемой реакции, представленной на рис. 3.47, а, где синим показано распределение электронов в молекулах воды и карбонильных связях. б) Кислота стремится отдать протон (H+) другим атомам. Соединяясь с кислородом карбонильной группы, кислота оттягивает электроны от углерода карбонильной группы, делая этот атом намного более привлекательным для электроотрицательного кислорода вступающей в реакцию молекулы воды.в)ОснованиестремитсяотобратьH+.Соединяясьсводородомучаствующейвреакциимолекулы воды, основание побуждает электроны сдвигаться к атому кислорода молекулы воды, делая ее более совершеннойреакционнойгруппойпоотношениюкуглеродукарбонильнойгруппы.г)Засчетособого расположенияатомовнасвоейповерхностиферментспособенодновременноосуществлятьикислотныйиосновныйкатализ.

слюне, слезах и других выделениях. Лизоцим катализирует разрезание полисахаридных цепей в клеточных стенках бактерий. Поскольку бактериальная клетка находится под давлением осмотических сил, разрезание даже небольшого числа полисахаридных цепей вызывает разрыв клеточной стенки и разрушение клетки. Лизоцим представляет собой относительно маленький и устойчивый белок, который можно легко выделить в больших количествах. По этим причинам его интенсивно изучали, и он был первым ферментом, структура которого была полностью определена на атомном уровне методами рентгеновской кристаллографии.

Реакция, которую катализирует лизоцим, относится к гидролизу: он присоединяет молекулу воды к одинарной связи между двумя соседними сахарными группами в полисахаридной цепи, таким образом вызывая разрыв этой связи (см. рис. 2.19). Такая реакция энергетически благоприятна, потому что свободная энергия разъединенной полисахаридной цепи ниже, чем свободная энергия неповрежденной цепи. Однако чистый полисахарид может сохраняться в воде годами, не претерпевая никакого заметного гидролиза. Это связано с тем, что для такой реакции существует энергетический барьер, о чем было сказано в главе 2 (см. рис. 2.46). Молекула воды может разрушить связь, соединяющую два сахара, только в том случае, если молекула полисахарида искажена и пребывает в определенной форме — переходном состоянии, — в котором окружающие эту связь атомы имеют видоизмененную геометрию и иное распределение электронов. Из-за этого искажения энергии активации, получаемой в результате случайных столкновений, становится достаточно для протекания реакции. В водном растворе при комнатной температуре энергия столкновений почти никогда не превышает энергию активации. Вследствие этого гидролиз, если и происходит, то чрезвычайно медленно.