Volume1
.pdf
338 Часть 2. Основные генетические механизмы
4.3.2. Гетерохроматин высокоорганизован и необычайно устойчив к экспрессии генов
Исследования на световых микроскопах в 1930-е гг. позволили различить два типа хроматина в интерфазных ядрах клеток многих высших эукариот: высокоспирализованную форму, названную гетерохроматином, и весь остальной, менее уплотненный хроматин, названный эухроматином. Гетерохроматин представляет собой особо компактную форму хроматина (см. рис. 4.9), и мы, наконец, начинаем понимать важные проявления его молекулярных свойств. Хотя он расположен во многих местах по всей длине хромосом, при всем при том он особенно сосредоточен в определенных областях и наиболее заметно — в центромерах и теломерах, о которых уже было сказано ранее (см. рис. 4.21). В типичной клетке млекопитающих более десяти процентов генома упаковано в такую форму гетерохроматина.
ДНК в гетерохроматине содержит очень немного генов, и те эухроматиновые гены, которые становятся упакованными в гетерохроматин, выключаются упаковкой такого типа. Однако теперь мы знаем, что термин гетерохроматин охватывает структуры хроматина нескольких различных типов, общей особенностью которых является особо высокая степень компактизации. Таким образом, о гетерохроматине следует думать не как о заключающем в себе «мертвую» ДНК, а скорее как о создающем различные типы компактного хроматина с разными свойствами, которые делают его очень устойчивым к экспрессии подавляющего большинства генов.
Когда ген, который обычно экспрессируется в эухроматине, экспериментально перемещают в область гетерохроматина, он прекращает экспрессироваться и умолкает, или, как говорят, заглушается. Такие отличия в экспрессии генов являются примерами позиционных эффектов (position effects), суть которых — в зависимости активности гена от его позиции относительно близлежащей области гетерохроматина на хромосоме. Изначально распознанные у дрозофилы позиционные эффекты к настоящему времени обнаружены у многих эукариот, в том числе у дрожжей, растений и человека.
Позиционные эффекты, связанные с гетерохроматином, показывают особен-
ность, названную мозаичным эффектом положения (position effect variegation),
который в прошлом стал важнейшим ключом к пониманию функции хроматина. У дрозофилы события разрыва хромосомы, которые непосредственно соединяют область гетерохроматина с областью эухроматина, как правило, инактивируют близлежащие эухроматиновые гены. Зона инактивации распространяется на различное расстояние в разных первых клетках зародыша мухи, но как только гетерохроматиновое состояние устанавливается в гене, оно обычно устойчиво наследуется всеми потомками этой клетки (рис. 4.36). Это замечательное явление было впервые открыто в ходе досконального генетического анализа причин мозаичной потери красного пигмента в мушином глазу (рис. 4.37); как оказалось, интенсивное распространение гетерохроматина участвует также в инактивации одной из двух X-хромосом у женских особей млекопитающих (см. разд. 7.4.16).
С целью поиска продуктов генов, которые усиливают или подавляют распространение гетерохроматина и его устойчивого наследования, — то есть генов, которые, будучи мутированы, или усиливают, или подавляют (супрессируют) эффект мозаичного типа, — был проведен массовый генетический скрининг как на дрозофиле, так и на грибах. С помощью этой методики было идентифицировано более 50-ти генов, которые играют определяющую роль в этих процессах. В последние
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 339
Рис.4.36.ОбъяснениеэффектараскраскимозаичноготипауDrosophila melanogaster. а)Распростране-
ниюгетерохроматина(зеленый)всмежныеобластиэухроматина(красный)обычнопрепятствуютспециальные последовательности барьерной ДНК, о которых мы поговорим вскоре. Однако у мух, которые унаследовали некоторые хромосомные перестройки, этот барьер более не присутствует. б) На ранних периодахразвитиятакихмухгетерохроматинможетраспространитьсянасоседнююхромосомнуюДНК, продвигаясьвразныхклеткахнаразличныерасстояния.Такоераспространениевскореостанавливается, ноустановившаясякартинараспределениягетерохроматинанаследуется,такчтопроизводятсябольшие клоныклетокпотомства,вкоторыходниитежесоседниегеныконденсированывгетерохроматинитаким образом инактивированы(отсюда «мозаичная»внешностьнекоторыхизтакихмух;см. рис.4.37). Хотя термин «распространение» употребляется для описания формирования нового гетерохроматина вблизисужеимеющимсягетерохроматином,этоттермин,бытьможет,неабсолютноточен.Естьданные, что во время расширения гетерохроматин может «перескочить» через некоторые области хроматина, избавляягены,которыележатвихпределах,отрепрессивныхмер.
Рис. 4.37. Открытие позиционных эффектов на основании экспрессии генов. Ген White у плодовой мушки дрозофила регулирует экспрессию пигмента глаза и назван по мутации, которая позволила его впервыеопознать.МухидикоготипаснормальнымгеномWhite(White+)имеютнормальнуювыработку пигмента,которыйобусловливаеткрасныйцветихглаз,но,еслигенWhiteмутированиинактивирован, мутантные мухи (White–) совершенно не производят этот пигмент и имеют белые глаза. У тех мушек, у которых нормальный ген White+ был перемещен в примыкающую к гетерохроматину область, глаза крапчатые с красными и белыми пятнами. Белые пятна представляют последовательности клеточных поколений, в которых ген White+ «умолк»
под влиянием гетерохроматина. Напротив, красныепятнапредставляютпоследователь-
ности клеточных поколений, в которых ген
White+ экспрессируется. На ранних стадиях развития,когдагетерохроматинизначально формируется, он распространяется на со-
седний эухроматин в различной степени в разных клетках эмбриона (см. рис. 4.36). Наличиекрупныхзонкрасныхибелыхклетокпоказывает,чтосостояниетранскрипционнойактивности,определяемоеупаковкой этогогенавхроматинвпредковыхклетках, унаследовановсемидочернимиклетками.
340 Часть 2. Основные генетические механизмы
годы получена подробная информация о свойствах белков, произведенных этими генами; как оказалось, многие из них представлены негистоновыми хромосомными белками, на которых и зиждется основание замечательного механизма регулирования генов эукариот — того, который требует точных последовательностей аминокислот стержневых гистонов. Поэтому данный механизм регуляции генов помогает объяснить поразительно медленное изменение гистонов с течением времени.
4.3.3. Гистоны стержня ковалентно модифицируются по множеству различных сайтов
Боковые цепи аминокислот всех четырех гистонов в стержне нуклеосомы подвергаются поразительно разнообразным ковалентным модификациям, включая ацетилирование лизинов, моно-, ди- и триметилирование лизинов, а также фосфорилирование серинов (рис. 4.38). Большое число такого рода модификаций боковых цепей происходит на восьми относительно бесструктурных N-концевых «гистоновых хвостах», которые высовываются из нуклеосомы (рис. 4.39). Однако встречаются также определенные модификации боковых цепей на дискообразном стержне нуклеосомы (рис. 4.40).
Рис. 4.38. Некоторые характерные типы ковалентных модификаций боковых цепей аминокислот в гистонах нуклеосом. а) Показаны три разных уровня метилирования лизина; каждый может быть опознансвоимсвязывающимсябелкоми,такимобразом,каждыйможетиметьсвоеособоезначение дляклетки.Обратитевнимание,чтоацетилированиеудаляетположительныйзарядслизинаи,чтонаиболееважно,ацетилированныйлизиннеможетбытьметилирован,инаоборот.б)Фосфорилирование серинасообщаетотрицательныйзарядгистону.Модификации,непоказанныездесь, —моно-илиди- метилирование аргинина, фосфорилирование треонина, присоединение ADP-рибозы к глутаминовой кислотеиприсоединениеубиквитина,СУМОилибиотиновойгруппыклизину.
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 341
Рис. 4.39. Ковалентная модификация хвостов стержневых гистонов. а) Структура нуклеосомы с обо-
значенным цветом местоположением первых 30-ти аминокислот в каждом из его восьми (зеленых) N-концевых гистоновых хвостов. б) Обозначены хорошо известные модификации четырех гистоновых стержневыхбелков.Хотяздесьдляобозначенияметилированияиспользуетсяодинсимвол(M),каждый лизин(K)илиаргинин(R)можетбытьметилированнесколькимиразличнымиспособами.Обратитевниманиетакжеинато,чтонекоторыепозиции(например,лизин9гистонаH3)могутбытьмодифицированы либометилированием,либоацетилированием,нонетемидругимвместе.Большинствоизпоказанных модификацийзаключаетсявприсоединенииотносительномаленькоймолекулыкгистоновымхвостам; исключение — убиквитин — 76-аминокислотный белок, используемый также в других клеточных про-
цессах (см. рис. 6.92). (Переработано из H. Santos-Rosa and C. Caldas, Eur. J. Cancer 41: 2381–2402, 2005.
СлюбезногоразрешенияиздательстваElsevier.)
342 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.40. Карта модификаций гистонов на поверхности кор-частицы нуклеосомы. Заметим, что ги-
стонные хвосты были здесь опущены (сравните с рис. 4.39). Функции большинства этих модификаций стержня еще не известны. (Переработано из M. S. Cosgrove, J. D. Boeke and C. Wolberger, Nut. Struct. Mol. Biol.11:1037–1043,2004.СлюбезногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Модификации всех вышеупомянутых типов обратимы. Модификация определенной боковой цепи аминокислоты в нуклеосоме осуществляется специфическим ферментом, причем в большинстве своем эти ферменты воздействуют только на один или несколько участков. За удаление каждой конкретной модификации боковой цепи отвечает иной фермент. Так, например, ацетильные группы присоединяются к определенным лизинам набором различных гистонацетилтрансфераз (HAT) и удаляются набором комплексов гистондезацетилаз (HDAC). Аналогичным образом метильные группы присоединяются к боковым цепям лизина набором различных гистонметилтрансфераз и удаляются набором гистондеметилаз. Каждый фермент направляется
копределенным участкам на хроматине в определенные моменты времени жизненного цикла каждой клетки. Начальная «вербовка» этих ферментов по большей части зависит от белков, регулирующих гены, – регуляторных белков (gene regulatory proteins), которые связываются с определенными последовательностями ДНК по длине хромосом и, в свою очередь, тоже производятся в разные периоды времени жизни организма, как описано в главе 7. Но, по крайней мере в некоторых случаях, ковалентные модификации на нуклеосомах могут сохраняться надолго, даже после того, как регулирующие гены белки, которые в свое время вызвали их, исчезнут, – и, таким образом, они несут в себе память об истории развития клетки. Поэтому различные группы нуклеосом могут сильно отличаться по схемам ковалентных модификаций, что зависит от их точного положения в хромосоме и от статуса клетки.
Модификации гистонов тщательно регулируются и имеют важные последствия. Ацетилирование лизинов по N-концевым «хвостам», как правило, разрыхляет структуру хроматина, отчасти потому, что присоединение ацетильной группы к лизину удаляет его положительный заряд и тем самым снижает сродство «хвостов»
ксоседним нуклеосомам (см. рис. 4.33). Однако наиболее глубокое воздействие модификаций гистонов заключается в их способности привлекать к отрезку хро-
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 343
Рис.4.41.Структуранекоторыхвариантовгистоноввсравнениисосновнымгистоном,которыйониза-
меняют.ЭтигистонывстраиваютсявнуклеосомынаопределенныхучасткаххромосомATP-зависимымифер- ментамиперестройкихроматина,которыедействуютсовместносгистоновымишаперонами(см.рис.4.30). РазновидностьгистонаH3CENP-Aобсуждаетсяпозжевэтойглаве(см.рис.4.48–4.51);другиеразновидности обсуждаютсявглаве7.Последовательности,которыеокрашеныпо-разномувкаждомварианте,отличаются отсоответствующейпоследовательностиосновногогистона.(ПереработаноизK. SarmaandD. Reinberg,Nat. Rev.Mol.CellBiol.6:139–149,2005.СлюбезногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
матина, который был соответствующим образом модифицирован, специфические белки. Эти новые белки определяют, как и когда гены будут экспрессированы, а так же предопределяют другие биологические функции. Вот так точная структура хроматинового домена определяет экспрессию генов, в нем упакованных, и тем самым — структуру и функцию эукариотической клетки.
4.3.4. Хроматин приобретает дополнительное разнообразие за счет наличия сайт-специфичной замены гистонов на их минорные варианты
Несмотря на устойчивую консервативность аминокислотных последовательностей четырех стержневых гистонов на протяжении сотен миллионов лет, эукариоты содержат по несколько разновидностей гистонов, которые собираются в нуклеосомы. Эти гистоны присутствуют в гораздо меньших количествах, чем основные гистоны, и их консервативность в течение длительных периодов эволюции не столь высока. Для всех стержневых гистонов, за исключением гистона H4, известны минорные варианты; некоторые примеры представлены на рис. 4.41.
Основные гистоны синтезируются главным образом во время S-фазы клеточного цикла (см. рис. 17.4) и собираются в нуклеосомы на дочерних нитях ДНК сразу за репликационной вилкой (см. рис. 5.38). Напротив, большинство минорных вариантов гистонов синтезируется на всем протяжении интерфазы. Часто
344 Часть 2. Основные генетические механизмы
они встраиваются в уже сформированный хроматин, для чего требуется процесс замены гистонов, катализируемый АТР-зависимыми комплексами перестройки хроматина, о которых было сказано ранее. Такие комплексы перестройки содержат субъединицы, которые индуцируют их связывание как с определенными участками на хроматине, так и с гистоновыми шаперонами, несущими на себе ту или иную разновидность гистона. В результате каждый вариант гистона встраивается в хроматин очень избирательно (см. рис. 4.30).
4.3.5. Вместе взятые, ковалентные модификации и разновидности гистонов образуют так называемый «гистоновый код», который помогает установить биологическую функцию
Число возможных различных меток на отдельной нуклеосоме огромно. Даже при учете того, что одни ковалентные модификации взаимно исключающие (например, невозможно одновременно и ацетилировать и метилировать лизин), а другие модификации совмещены, будучи выстроены в единую цепь в виде набора событий, ясно, что возможны тысячи их сочетаний. Это разнообразие пополняется за счет нуклеосом, которые содержат разновидности основных гистонов.
Многие из комбинаций, кажется, имеют определенное значение для клетки, потому что они определяют, как и когда к ДНК, упакованной в нуклеосомах, открывается доступ; такие наблюдения привели ученых к выдвижению гипотезы о ги- стоновом коде (histone code). Например, метка одного типа сигнализирует о том, что отрезок хроматина был недавно реплицирован, другая метка сигнализирует, что ДНК в этом хроматине была повреждена и нуждается в восстановлении, тогда как многие другие сигнализируют о том, когда и как должна проводиться экспрессия генов. Малые белковые модули связываются с определенными метками, опознавая,
Рис.4.42.Считываниеметокнануклеосомах.Показанаструктурабелковогомодуля,которыйспецифично узнает гистон H3, триметилированный по лизину 4. а) Объемная модель домена ING PHD, связанного сгистоновымхвостом(зеленый,триметильнаягруппавыделенажелтым).б)Ленточнаямодель,пока- зывающая,какраспознаютсяшестьN-концевыхаминокислотнахвостегистонаH3.Пунктирныелинии изображают водородные связи. Это один из многих доменов PHD, которые узнают метилированные лизинынагистонах;различныедоменыпрочносвязываютсяслизинами,расположеннымивразличных позициях,испособныпроводитьразличиемеждумоно-,ди-итриметилированнымлизином.Подобным же образом, прочие малые белковые модули узнают определенные боковые цепи гистонов, которые помеченыацетильными,фосфатнымиидругимигруппами.(ПереработаноизP. V. Penaetal.,Nature442:
100–103,2006.СлюбезногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 345
например, триметилированный лизин 4 на гистоне H3 (рис. 4.42). Эти модули, как думают, действуют совместно с другими модулями и выступают частью комплекса считывания кода (code-reader complex), который позволяет специфическим комбинациям меток на хроматине привлекать дополнительные белковые комплексы, которые исполнят соответствующую им биологическую роль в нужное время (рис. 4.43).
Метки на нуклеосомах, образуемые ковалентными модификациями гистонов, динамичны, будучи постоянно удаляемыми и устанавливаемыми с быстротой, которая зависит от их местоположения на хромосоме. Поскольку гистоновые хвосты «высунуты» из нуклеосомы в направлении от стержня в стороны и с большой
Рис.4.43.Принципиальнаясхема,показывающая,какгистоновыйкодможетсчитыватьсякомплексом считываниякода.Нарисункесхематичнопоказан(зеленым)крупныйбелковыйкомплекс,которыйсодержитрядбелковыхмодулей,каждыйизкоторыхраспознаетспецифическуюгистоновуюметку.Такой «комплекс считывания кода» связывается сильно только с областью хроматина, в которой содержится несколько различных гистоновых меток, узнаваемых им. Поэтому только определенная комбинация метоквызоветсвязываниекомплексасхроматиномипривлечетдополнительныебелковыекомплексы (фиолетовый),которыекатализируютоднуилинесколькобиологическихфункций.
346 Часть 2. Основные генетические механизмы
вероятностью доступны, даже когда хроматин уплотнен, они, казалось бы, обеспечивают особенно подходящий формат для создания меток в форме, которая может быть легко видоизменена всякий раз, когда клетка потребует перемен. Хотя многое еще предстоит узнать о значении многих различных комбинаций гистонового кода, несколько хорошо изученных примеров информации, которая может быть закодирована в хвосте гистона H3, представлены на рис. 4.44.
Рис. 4.44. Некоторые определенные значения гистонового кода. а) Модификации на N-концевом хвосте гистона H3 показаны сообразно обозначениям на рис. 4.39. б) Хвост гистона H3 может быть помечен различными комбинациями модификаций, которые придают определенное «значение» отрезкухроматина,гдетакаякомбинациярасположена.Известнолишьнесколькотакогородазначений, втомчислечетырепредставленныхпримера.Обратимвниманиенаодинпример:триметилирование лизина 9 привлекает специфичный к гетерохроматину белок HP1, что вызывает распространяющуюся волну дальнейшего триметилирования лизина 9, за которым следует дальнейшее связывание HP1, согласно общей схеме, которая будет проиллюстрирована вскоре (см. рис. 4.46). Не показан тот факт, которыйтолькочтообсуждался(см.рис.4.43),чтосчитываниегистоновогокодаобычнопредполагает сопутствующее «общее» узнавание метки на других участках нуклеосомы, наряду с показанным узна- ваниемхвостагистонаH3.Крометого,требуютсяопределенныеуровниметилирования(моно-,ди-или триметильныегруппы),какэтопоказанонарис.4.42.
4.3.6. Комплекс код-считывающих и код-записывающих белков может распространять специфические модификации хроматина по хромосоме на большие расстояния
Явление мозаичного эффекта положения, описанное ранее, требует, чтобы по крайней мере некоторые модифицированные формы хроматина имели возможность
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 347
распространяться на значительные расстояния по молекуле хромосомной ДНК (см. рис. 4.36). Как такое возможно?
Ферменты, которые модифицируют гистоны (или удаляют с них модификации)
внуклеосомах, являются частью мультисубъединичных комплексов. Они могут первоначально быть принесены к определенной области хроматина одним из сайтспецифичных к последовательности ДНК-связывающих белков (регулирующих гены белков), которые мы обсудим в главах 6 и 7 (конкретный пример можно увидеть на рис. 7.87). Но после того как модифицирующий фермент «запишет» свою метку на одной или нескольких соседних нуклеосомах, могут последовать события, напоминающие цепную реакцию. В этом случае код-записывающий (code writer) фермент работает совместно с код-считывающим (code-reader) белком, находящимся
втом же белковом комплексе. Этот второй белок содержит модуль считывания кода, который опознает метку и сильно связывается с недавно модифицированной нуклеосомой (см. рис. 4.42), помещая прикрепленный к нему записывающий фермент вблизи соседней нуклеосомы. Посредством множества таких циклов чтениязаписи считывающий белок может переносить записывающий фермент вдоль ДНК, распространяя метку по цепочке «из рук в руки» по хромосоме (рис. 4.45).
Вдействительности данный процесс более сложен, чем только что описанная схема. И считывающие, и записывающие «устройства» являются частями белкового комплекса, который, вероятно, содержит множество и тех, и других и требует присутствия множественных меток на нуклеосоме – чтобы распространять их. Более того, многие из таких ком-
плексов «чтения-записи», или «читатель-писатель» (readerwriter), содержат также АТРзависимый белок перестройки хроматина, при этом считывающие, записывающие и пере-
Рис. 4.45. Как набор комплекса «чтения-записи» кода может распространить изменения хроматина по хромосоме. Белок записи кода представляет собой фермент, который создаетспецифическуюмодификациюна одномилинесколькихизчетырехгистоновнуклеосомы.Послеего«вербовки» на определенном участке хромосомы регулирующим гены белком записывающий белок («писатель») сотрудничает с код-считывающим белком («читатель»), чтобы распространять свою меткуотнуклеосомыкнуклеосомепосредством изображенного комплекса «чтения-записи». Для того чтобы этот механизмработал,считывающийбелок должен опознавать ту же метку модификациигистона,которуювноситзаписывающийбелок(см.такжерис.4.43).