Линкеры

Линкер – это молекулярный фрагмент, ковалентно связанный с твердой подложкой. Он содержит реакционноспособные функциональные группы, с которыми взаимодействует первый реагент и который в результате становится связанным со смолой. Образующаяся связь должна быть стабильной в реакционных условиях, но легко разрываться на конечной стадии синтеза.

Различные линкеры используются в зависимости от того, какая функциональная группа присутствует в субстрате и от того, какая функциональная группа должна быть сформирована в конце процедуры.

В практике комбинаторного синтеза чаще всего используются следующие линкеры:

• Хлорметильный (-CH₂Cl),

• Гидроксильный (-OH),

• Аминный (-NH₂),

• Альдегидный (-CHO),

• Силильный (-OSiR₃).

Тип линкера	Тип смолы	Что присоединяет	Что синтезирует	Чем осуществляется разрыв
Галогенметил		Карбоновые кислоты, спирты, фенолы, тиолы, амины	Кислоты, спирты, сложные эфиры, тиоэфиры	TFMSA, H2/Pd, i-Bu2AlH, MeONa, HF
Галогенметил		Алкил и ариламины	Анилиды и сульфамиды	CF3COOH, SOCl2/CF3COOH
Галогенметил		Спирты, кислоты, фенолы, тиолы, амины	Спирты, кислоты, тиолы, амины, сложные эфиры	1-5% CF3COOH, 30% гексафторизопропанол
Гидроксил		Спирты, кислоты	Спирты, кислоты, амиды	CF3COOH, амин/AlCl3, i-Bu2AlH
Гидроксил		Спирты, кислоты	Спирты, кислоты	5% CF3COOH, 10% AcOH
Гидроксил		Кислоты	Кислоты	Свет с длиной волны 365 нм. Линкер стабилен к CF3COOH и пиперидину
Гидроксил		Кислоты	Амиды кислот, спирты, сложные эфиры, гидразиды	Нуклеофилы (NaOH,NH3/MeOH, NaBH4/EtOH, MeOH/CF3COOH, NH2NH2/DMF
Гидроксил		Защищенные пептиды, ки-слоты	Циклические пепти-ды, мочевины	25% CF3COOH, гидразиды
Гидроксил Линкер Ринкера		Спирты, кисло-ты, фенолы	Спирты, кислоты, фенолы	1-5% CF3COOH
Амино		Кислоты	Карбоксамиды	95% CF3COOH
Амино		Кислоты	Защищенные амиды	1% CF3COOH
Амино		Кислоты	Альдегиды и кетоны	LiAlH4 и реактивы Гриньяра
Амино		Карбоновые кислоты	Амиды или карбоновые кислоты	Активация сульфонамида диазометаном или бромацетонитрилом с последующей атакой нуклеофилом амина или гидроксида
Альдегид		Первичные или вторичные спирты	Спирты	95% CF3COOH/H2O или CF3COOH/CH2Cl2/EtOH
Альдегид		Амины	Карбоксамиды, сульфонамиды	CF3COOH

Смолы Ванга могут быть использованы в пептидном синтезе посредством N-защищенной аминокислоты, связанной с линкером эфирной связью. Такая эфирная связь устойчива к сочетанию и стадии снятия защиты, но может быть разрушена трифторуксусной кислотой для снятия конечного пептида с гранулы смолы.

Субстраты с карбоксильной группой могут быть связаны со смолой Ринка через амидную связь. Как только процедура заканчивается, взаимодействие с трифторуксусной кислотой освобождает продукт с первичной амидной группой.

Первичные и вторичные спирты могут быть связаны со смолой, модифицированной дигидропираном. Связывание спирта происходит в присутствии 4-толуолсульфоната в дихлорметане. Снятие продукта происходит с использованием трифторуксусной кислоты.

Первый синтез  пептидного гормона – окситоцина

В 1953 г. американский ученый Винсент Дю Виньо совместно с сотрудниками выяснил строение окситоцина – циклического полипептида. Cреди известных природных соединений подобные циклические структуры ранее не встречались. В следующем году ученый впервые осуществил синтез этого вещества. Это был первый случай синтеза полипептидного гормона в условиях in vitro.

Дю Виньо известен в научном мире своими исследованиями на стыке химии и медицины. В середине 1920-х гг. предметом его научного интереса было изучение функции серы в инсулине – гормоне поджелудочной железы, регулирующем процесс углеводного обмена и поддержания нормального уровня сахара (глюкозы) в крови. Интерес молодого человека к химии инсулина зародился, по его воспоминаниям, после одной из лекций, прочитанных профессором Уильямом К.Розе сразу же после открытия этого вещества Фредериком Г.Бантингом и Джоном Дж.Р.Маклеодом. Поэтому, когда после окончания университета Джон Р.Мурлин из Рочестерского университета предложил ему заняться изучением химической природы инсулина, молодой ученый посчитал это предначертанным судьбой предложением. «Шанс поработать над химией инсулина перечеркнул все остальные мои научные ожидания, – отмечал впоследствии Дю Виньо, – поэтому я сразу же принял предложение профессора Мурлина». За время работы в Рочестерском университете Дю Виньо удалось высказать первые предположения о химическом составе инсулина, которые в значительной степени были отражены в его диссертации «Сера инсулина», защищенной в 1927 г. Согласно воззрениям Дю Виньо инсулин являлся одним из производных аминокислоты цистина. Он идентифицировал инсулин как серосодержащее соединение, в котором серные фрагменты представляют собой дисульфидные мостики. Он высказал также соображения о пептидной  природе инсулина. Следует отметить, что данные Дю Виньо о том, что инсулин является серосодержащим соединением, хорошо согласовывались с основными выводами работ, проводимых в то время в этом направлении профессором Джоном Якобом Абелем с сотрудниками в университете Джона Хопкинса. Поэтому стипендия Национального исследовательского совета, которую молодой ученый получил сразу же после защиты диссертации, оказалась очень кстати. Благодаря ей, Дю Виньо работал некоторое время под руководством профессора Абеля в медицинской школе университета Джона Хопкинса. Профессор Абель, признанный авторитет в области изучения химии гормонов, придерживался в то время точки зрения, что инсулин является белковым соединением. Такие взгляды шли вразрез с доминировавшими в те годы представлениями. Как вспоминал сам Дю Виньо, «это было время, когда как химики, так и биологи никак не могли воспринять тот факт, что энзим может быть белковым соединением». Незадолго до этого профессор Абель смог впервые выделить инсулин в кристаллическом виде (1926). В планы Дю Виньо, когда он устроился на стажировку к Абелю, входило следующее: выделить из кристаллов инсулина аминокислоту цистин и попытаться изучить ее строение. Это ему очень быстро удалось осуществить. В результате исследований совместно с сотрудниками профессора и при его непосредственной помощи молодой ученый наглядно продемонстрировал образование ряда аминокислот при расщеплении молекулы инсулина. Одной из них была как раз серосодержащая аминокислота цистин. При этом опыты показали, что содержание серы в инсулине прямо соотносится с содержанием серы в цистине. Но достигнутые результаты требовали изучения других серосодержащих аминокислот.  Продолжение финансовой поддержки со стороны Национального исследовательского совета еще на один год позволило Дю Виньо посетить известные научные биохимические школы Западной Европы (Дрезден, Эдинбург, Лондон), там он смог получить дополнительный опыт в области изучения пептидов и аминокислот. По возвращении в США ученый сначала работал в Иллинойском университете, а через три года перешел в медицинскую школу университета Джорджа Вашингтона. Здесь он продолжал свои исследования инсулина. Особенно интересными оказались его работы по изучению влияния дисульфидных связей в цистине на гипогликемический эффект инсулина (понижения сахара в крови). Работы в области инсулина стимулировали также новое направление исследований – изучение гормонов гипофиза. Важным направлением его работ в университете Джорджа Вашингтона стало изучение механизма конверсии метионина в цистин в живых организмах. В последующие годы именно эти исследования подвели его к проблеме изучения биологического трансметилирования (переноса метильных групп от одной молекулы на другие). В 1938 г. ученый был приглашен в Медицинский колледж Корнеллского университета. Здесь он продолжил изучение инсулина и развернул исследования по изучению гормонов задней доли гипофизной железы. В годы второй мировой войны эти исследования пришлось на время прервать. Ученый со своими сотрудниками работал над синтезом пенициллина. По окончании войны Дю Виньо смог вернуться к прежним исследованиям. Особенно интенсивно он занялся работами по выделению ряда гормонов из коммерчески доступных экстрактов гипофиза и тканей гипофиза быка и свиньи. Задняя доля гипофизной железы вырабатывает ряд гормонов, два из которых к тому времени были выделены в чистом виде. Один из них – окситоцин, стимулирующий гладкую мускулатуру матки, другой – вазопрессин – гормон, сокращающий периферические артериолы и капилляры, тем самым обусловливая повышение давления крови. Эти гормоны, как оказалось, очень трудно различать, т. к. они обладают сходными физическими свойствами. Именно из-за этого до середины 1920-х гг. медики и биохимики считали их одним веществом, обладающим широким спектром биологической активности. Благодаря совершенствованию методов химического анализа, в  частности фракционного осаждения, хроматографии и электрофореза, к 1940-м гг. эти гормоны удалось частично разделить. В 1949 г. Дю Виньо, применив метод «противоточного распределения» для продажного экстракта, имеющего окситоциновую активность 20 ед/мг, получил препарат с активностью 850 ед/мг. Это сподвигло ученого предпринять попытку изучить строение вещества. С этой целью он осуществил фрагментацию полипептидной цепи. В результате полного гидролиза препарата окситоцина и данных анализа его аминокислотного состава Дю Виньо было установлено наличие восьми различных аминокислот в эквимолекулярном соотношении. Количество выделившегося аммиака соответствовало трем амидным группам типа  –CONH₂, молекулярная масса – мономерному октапептиду. Один из восьми аминокислотных остатков был идентифицирован как цистин. Опыты по окислению цистина в окситоцине показывали, что обнаруженный ранее Дю Виньо дисульфидный мостик в цистине является частью кольцевой системы окситоцина. Последовательность восьми аминокислот в окситоцине была установлена Дю Виньо с сотрудниками окончательно лишь в 1953 г. Следует отметить, что параллельно группе Дю Виньо над теми же проблемами в Вене работал профессор Ганс Туппи (Венский университет), который также в 1953 г. независимо от Дю Виньо установил последовательность аминокислот в окситоцине, использовав в своей работе метод Сенгера. Дю Виньо шел несколько иным путем. Он и его сотрудники основывались главным образом не на анализе концевых аминокислот, а на идентификации компонентов большого числа низших пептидов. Они исследовали также реакцию окисленного окситоцина с бромной водой, в результате которой образовывались гептапептид и бромированный пептид. Изучение строения последнего показывало, что последовательность аминокислот в соответствующем дипептиде: цистин – тиразин. Далее динитрофенильным методом было установлено, что N-концевой аминокислотой в гептапептиде является изолейцин. По заключению Дю Виньо из этого вытекает, что N-концевая последовательность в окисленном окситоцине:

HO₃S – цис – тир – изл.

Аминокислоты из гормона окситоцина

Из тринадцати перечисленных ниже пептидов первые четыре были получены частичным гидролизом гептапептида, вторая группа – гидролизом окситоцина (при этом цистеиновые остатки превращались в остатки аланина). Затем отделяли нейтральную фракцию и обрабатывали бромной водой для окисления цистеинового звена в звено цистеиновой кислоты; полученный кислый пептид отделяли от нейтрального на ионнообменных смолах. Третья группа пептидов была получена гидролизом окситоцина, десульфированного на никеле Ренея. В приводимых ниже формулах, если последовательность аминокислот в пептидах известна, символы аминокислот разделены тире; если последовательность неизвестна, то символы разделены запятой.

Из гептапептида:

1. (асп – цис – SO₃H). 2. (цис – SO₃H, про). 3. (цис – SO₃H, про, лей). 4. (цис – SO₃H, про, лей, гли).

Из окситоцина:

5. (лей, гли, про). 6. (тир, цис – S – S – цис, асп, глу, лей, изл). 7. (тир, цис – S – S – цис, асп, глу). 8. (цис – S – S – цис, асп, глу). 9. (цис – SO₃H, асп, глу).

Из десульфированного окситоцина:

10. (ала, асп). 11. (ала, асп, глу). 12. (глу, изл). 13. (ала, асп, глу, лей, изл).

Учитывая строение полученных пептидов и используя наложение отдельных компонентов пептидов, Дю Виньо с сотрудниками вывел следующую последовательность аминокислот в окситоцине:

цистин – тиразин – изолейцин – глутамин – NH₂ – аспарагин – NH₂ – цистин – пролин – лейцин – глицин – NH₂.

Установленная ими структура окситоцина представлена на рис. 1.

Рис.1.  Структура окситоцина, определенная Дю Виньо с сотрудниками

Следует отметить, что одновременно с окситоцином Дю Виньо была определена структура другого гормона задней доли гипофиза – вазопрессина. Структура гормона окситоцина была подтверждена его химическим синтезом в 1954 г., что являло собой впервые осуществленный полный синтез природных пептидов. Синтез включал конденсацию N-карбобензокси-S-бензилдипептида (I) с триамидом гептапептида (II) с помощью тетраэтилпирофосфита. После удаления карбобензокси- и бензильных групп, защищавших амино- и сульфгидрильные группы соответственно в обоих пептидах, образовавшийся нонапептид окисляли воздухом, в результате чего был получен окситоцин (рис. 2).  Так были осуществлены первый структурный анализ и первый синтез полипептидного гормона – выдающееся достижение в биохимии и медицине. С работ Дю Виньо в науке началась эра химического синтеза биологически активных природных пептидов.

Рис.2.  Общая схема синтеза окситоцина по Дю Виньо

Как известно, в 1955 г. Дю Виньо была вручена Нобелевская премия по химии «за работу с биологически активными соединениями, и прежде всего за впервые осуществленный синтез полипептидного гормона».