Лабораторная работа №6 Количественное определение активности сывороточной холинэстеразы. Изучение ингибирующего действия карбофоса и активирующего действия ионов кальция.

Различают два типа холинэстераз (ХЭ): ацетилхолинэстераза (АХЭ, истинная ХЭ, К.Ф.3.1.1.7) и бутирилхолинэстераза (сывороточная ХЭ, псевдохолинэстераза, К.Ф.3.1.1.8). Ферменты являются простыми белками, относятся к классу гидролаз и подклассу эстераз.

Ацетилхолинэстераза - фермент, катализирующий расщепле­ние ацетилхолина на одноатомный азотсодержащий спирт холин и уксусную кислоту, содержится в мозгу, печени, почках, мышцах, эритроцитах и дру­гих тканях. Ацетилхолин участвует в передаче нервных импульсов в ка­честве химического медиатора в синапсах центральной и периферической нервной системы, выделяясь в синаптическую щель в момент проведения импульса. Его ферментативное расщепление необходимо для подготовки постсинаптической мембраны к про­ведению нервного импульса. Ацетилхолинэстераза нервной ткани связана с наружной стороной постсинаптической мембраны, состоит из однородных глюкопротеидных субъединиц, чаще из четырех. Система «ацетилхолин-холинэстераза» участвует в регуляции возбудимости и сократимости гладкой и сердечной мышц, в осуществлении процессов активного и пассивного переноса ионов через мембраны эритроцитов и мышц.

Холинэстераза в основном содержится в печени, поджелудочной железе, слизистой кишечника, легких и сыворотке. Возмож­но, что постоянное присутствие чрезвычайно активной ХЭ в плазме крови является защитным приспособлением и предотвращает распространение по тканям ацетил­холина при его попадании в кровяное русло.

Показано, что в не­больших количествах ХЭ содержится и в центральной нервной системе. Существует предположение, что роль ХЭ нервной системы сводится к за­щите АХЭ от угнетающего действия таких эфиров холина, которые практически не разрушаются АХЭ, но могут образоваться в организме (пропионилхолин, бутирил­холин, валерилхолин и др.), а ХЭ их разрушает. Возможно также, что в отдельных участках мозга могут создаваться ненормально высокие концентрации ацетилхоли­на, избыток которого, как известно, тормозит АХЭ, но не влияет на активность ХЭ, которая его разрушает.

На активность фермента могут влиять специфические факторы: ингибиторы и активаторы. К специфическим необратимым ингибиторам ацетилхолинэстеразы относятся эфиры фосфорной кислоты: алкилфосфаты, фосфонаты, которые применяются в качестве инсектицидов, боевые отравляющие вещества – зарин, заман, табун, а также некоторые фармакологические препараты – армин, фосфакол, хлорофтальм. Обратимые ингибиторы – тетраалкиламмониевые соли: физостигмин, прозерин, эдрофоний. Активируют ацетилхолинэстеразу ионы кальция и магния.

По данным А. А. Покровского (1961), существует свыше 100 вариантов ме­тодов химического определения холинэстеразной активности в крови, в большинстве своем основанных на определении скорости образования уксусной кислоты (т. е. одно­го из продуктов реакции) и различающихся по способам этого определения. Методы делятся на манометрические, титриметрические, колориметрические и спектрофотометрические. Существует экспресс-метод определения активности ХЭ в сыворотке крови с использованием хроматографической бумаги, пропитанной ацетилхолином и индикатором, изменяющим окраску в зависимости от рН среды.

Цель работы освоить метод определения активности холинэсте­разы. Изучить действие на активность холинэстеразы ингибиторов и активаторов.

Принцип метода: основан на смещении рН буферного раствора уксусной кислотой образующейся в результате гидролитического ферментативного расщепления ацетилхолина, что устанавливают с помощью индикатора.

Схема реакции:

Cl Cl

CH₃COOCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃ + H₂O --------> CH₃COOH + НOCH₂CH₂N⁺(CH₃)₃

Ацетилхолинхлорид АХ Э уксусная холинхлорид

кислота

Реактивы и оборудование:

1. Боратный буфер, рН 8,4. 2. Ацетилхолинхлорид 3% раствор. 3 .Индикатор фенолрот. 4. Кальций хлорид – 0,1 н раствор. 5. Карбофос - 1% раствор.

6. Дистиллированная вода. 7. Термостат 37°С. 8. Пробирки и пипетки для реактивов. 9. Фотоэлектроколориметр

Ход работы: В 4 пробирки отмеривают по 0,1 мл сыворотки крови, добавляют по 1 мл боратного буферного раствора рН=8,4. 3атем в соответствии с таблицей в пробирки добавляют дистиллированную воду, СаС1₂ и карбофос, перемешивают содержимое пробирок встряхиванием и оставляют на 5 мин. при комнатной температуре. Через 5 мин. в про­бирки N 2,3,4 добавляют по 0,5 мл ацетилхолина и помещают все пробы в термостат при 37°С на 1 час.

N проби­рок	1	2	3	4
Сыворотка (мл)	0,1	0,1	0,1	0,1
Буфер (мл)	1,0	1,0	1,0	1,0
Вода дист. (мл)	1,0	0,5	―	―
СаС12 (мл)	—	—	0,5	—
Карбофос (мл)	—	—	—	0,5
Ацетилхолин (мл)	―	0,5	0,5	0,5

Результаты эксперимента.

Плотность (Д)
Д1 – Д 2,3,4	―
Активность ХЭ ммоль/л·ч	―

После инкубации в каждую пробирку добавляют по 1,0 мл дистиллированной воды и по 2 капли раствора индикатора. Затем пробы колориметрируют на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (=540 нм) в кюветах с толщиной слоя жидкости 10 мм, в качестве контроля используют дистиллированную воду.

Результаты измерений вносят в таблицу. Из показателей абсорбции стандартной (1) пробы вычитают значения оптической плотности опытной (2,3,4). Рассчитывают активность ХЭ по калибровочному графику. Для построения калибровочного графика используют разведения 0,1 н уксусной кислоты с ее содержанием в пробе от 4 до 18 мкмоль в пробе, что соответствует активности ХЭ от 80 до 360 ммоль/(л·ч).

Активность ХЭ в сыворотке в норме составляет 160-340 ммоль/(л·ч).

Вывод: