1 модуль Микробиология

тить гіпоксантин, аміноптерин і тимідин); лімфоцити в такому середовищі не гинуть. Гібридоми, що виникають при злитті клітин, успадковують від В-лімфоцитів здатність до синтезу специфічних імуноглобулінів і здатність розмножуватися в селективному середовищі ГАТ, а від мієломної клітини - здібність до нескінченного розмноження.

Процес отримання гібридом включає наступні стадії:

1.Отримання лінії мієломних клітин. Частіше з цією метою застосовують мишачі або щурячі клітинні лінії;

2.Отримання імунних В-лімфоцитів (антитілоутворюючих клітин) з селезінки імунізованих відповідним антигеном тварин;

3.Виділення гібридом і відбір з них клона, що цікавить;

4.Накопичення клітин отриманого клона для його практичного використання.

Перевагою гібридом є те, що за їх допомогою можливе отримання необмеженої кількості антитіл, які зберігають свою специфічність і чутливість. Моноклональні антитіла широко використовують для визначення білків крові і інших біологічних рідин, гормонів, ростових чинників, клітинних рецепторів, медіаторів запалення і імунітету, бактерійних і вірусних антигенів, різних отрут і ін. Моноклональні антитіла, завдяки своїй високій специфічності, стандартності і технологічності отримання витісняють і замінюють імунні сироватки.

Конкретні цілі:

1.Ознайомлення з етапами отримання антитоксичних сироваток у виробничих умовах.

2.Ознайомлення з принципами і стадіями отримання гамаглобулі-

нів.

3.Ознайомлення з принципами постановки реакції нейтралізації і титруванням антитоксичних сироваток.

4.Ознайомлення з механізмом алергічних реакцій і сироваткової хвороби, які виникають на введення сироваток.

Уміти:

1.Проводити реакцію нейтралізації.

2.Проводити розрахунок титру сироватки в поставленому досвіді.

Теоретичні питання:

1.Класифікація імунних сироваток.

2.Лікувальні і профілактичні сироватки і їх застосування.

3.Діагностичні сироватки і їх застосування в серологічних реакціях.

4.Отримання імунних сироваток від тварин і людей.

5.Отримання гамаглобулінів.

6.Антитоксини. Механізм їх дії.

7.Титрування антитоксичних сироваток.

91

8.Класифікація реакцій гіперчутливості.

9.Ускладнення, які можуть виникати при введенні імунних сироваток. Механізм їх виникнення.

10.Отримання моноклональних антитіл.

Практичні завдання, які виконуються на занятті:

1.Постановка реакції флокуляції для титрування антитоксичної сироватки (дифтерійної) за схемою.

2.Облік реакції.

3.Оформлення протоколу (запис схеми постановки реакції і обчислення титру сироватки).

Література:

1.Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкова Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. – М.: Медицина, 1998. – 336 с.

2.Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.–

М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– 768 с.

3.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 691с.

4.Конспект лекцій.

Додаткова література:

1.Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка. – Київ: Медицина, 2004. – С. 300-333.

2.Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии. – Харків, 2005. – 28 с.

Короткі методичні вказівки для роботи на практичному занятті:

На початку заняття проводиться перевірка рівня підготовки студентів до заняття.

Самостійна робота складається з проведення реакції нейтралізації для визначення титру антитоксичної сироватки за Рамоном. Для цього в пробірках (in vitro) використовують токсин і сироватку, яка містить антитіла до цього токсину. При їх змішуванні утворюється легке помутніння, потім з'являється дрібна суспензія, яка в кінці осідає на дно пробірки. Осад називається флокулянт, тому реакція називається реакція флокуляції. Помутніння, перш за все, з'являється в тій пробірці, де кількість токсину еквівалентна кількості антитіл. Ця особливість була використана у виробництві антитоксичних сироваток для визначення кількості антитоксичних (міжнародних) одиниць в 1 мл виготовленої сироватки.

За 1 МО приймають ту найменшу кількість сироватки, яка може нейтралізувати 100 смертельних доз токсину (100 Dlm).

В кінці лабораторної роботи студенти проводять аналіз результатів реакції і вносять їх до протоколу.

92

Цільові навчальні завдання:

1. Хворій дифтерією дитині віком 10 років була введена велика доза протидифтерійної сироватки. На 10 добу після введення сироватки у неї підвищилася температура до 38,5 °С, з'явився висип на шкірі, свербіння, набряклість і біль в суглобах. Вкажіть причину виникнення даних симп-

Е. Крапивниця 2. При практичному використанні лікувальних антитоксичних сирова-

ток хворому завжди вводять точно певні дози. У яких одиницях визначається активність антитоксичної протидифтерійної сироватки?

3. Хлопчик 1,5 років, що не отримував планові щеплення контактував з хворим на кір. З метою екстреної специфічної профілактики хлопчикові був введений донорський гама-глобулін. Який вид імунітету було створе-

4. Жінка, 54 років, звернулася до лікаря зі скаргами на нестерпність курячих яєць, яка з'явилася недавно. Антигістамінні препарати, призначені лікарем, дещо поліпшили стан хворої. Які антитіла сприяють розвитку

5. У жінки, 37 років, протягом року періодично виникали інфекційні захворювання бактерійного генеза. Хвороба була тривала, ремісії короткочасні. При обстеженні виявлена гіпогаммаглобулінемія. Порушення

Алгоритм лабораторної роботи:

1.Визначення поняття “Імунні сироватки”, їх класифікація.

2.Ознайомлення з прикладами застосування сироваток для профілактики, лікування і діагности.

3.Методи отримання імунних сироваток, гаммаглобулінів і моноклональніх антитіл.

4.Визначення титру антитоксичної сироватки в реакції нейтраліза-

ції.

5.Оформлення протоколу.

93

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ ДЛЯ СТУДЕНТІВ ДО ПРАКТИЧНОГО ЗАНЯТТЯ № 20

Тема: Вакцини. Вчення про фагоцитоз.

Мета: Вивчення імунобіологічних препаратів для специфічної профілактики. Вивчення ролі клітинних чинників захисту організму від інфекційних агентів.

Модуль 1. Морфологія і фізіологія мікроорганізмів. Інфекція. Імунітет.

Змістовний модуль 5. Реакції імунітету. Імунопатологія. Тема заняття 20. Вакцини. Вчення про фагоцитоз.

Актуальність теми. У загальному аспекті протиепідемічних заходів велике значення надається профілактиці інфекційних захворювань. Вакцини - це імунобіологічні препарати, які призначені для створення активного специфічного імунітету. Крім того вакцини можуть бути використані для лікування інфекційних хвороб. Початком вакцин, що діє, є специфічний антиген. Як антиген використовують живі мікроорганізми (бактерії, віруси); інактивовані мікроорганізми; виділені з мікроорганізмів специфічні, так звані протективні, антигени; токсини, які виділяють мікроби; хімічно синтезовані антигени, аналогічні природним; антигени, отримані за допомогою генної інженерії.

Вакцини повинні бути: 1) безпечними - не викликати захворювання, поствакцинальні реакції і ускладнення; 2) імуногенними - викликати розвиток надійного і тривалого імунітету; 3) стандартними - містити рівну кількість імуногенної речовини в одиниці об'єму. Вакцини вводять в організм внутрішньом'язово, на шкіру, підшкірно, внутрішньошкірно, перорально, через слизову оболонку носа і зіву. Активний імунітет створюється через 10-12 діб після введенні вакцини.

Розрізняють наступні вакцини: з живих ослаблених мікроорганізмів, з інактивованих (убитих) мікроорганізмів, хімічні, анатоксини, субкомпонентні, генно-інженерні, синтетичні, антиідиотипічні і ДНК-вакцини.

Живі вакцини. Першу живу вакцину використовував Е. Дженнер у 1796 році. Він показав, що щеплення людям збудника коров'ячої віспи оберігає їх від зараження натуральною віспою.

Живі вакцини готують з ослаблених (атенуйованих) штамів мікроорганізмів. Атенуйованими називають штами, які під впливом тих або інших чинників втратили вірулентність, але зберегли імуногенність. Вакцинні штами отримують шляхом селекції, в умовах підвищеної температури, дією бактеріофагів, антибіотиків, пасажами через тварин і несприят-

94

ливі живильні середовища. До живих вакцин відносять віспяну, поліомієлитну (вакцину Себіна), грипозну, БЦЖ, туляремічну, бруцельозну.

Живі вакцини створюють триваліший імунітет, який може зберігатися впродовж багатьох років.

До живих вакцин відносять так звані векторні рекомбінантні вакцини. Їх отримують, вбудовувавши в геном (ДНК) вакцинного штаму вірусу або бактерії ген чужорідного антигена. Вже отримані рекомбінантніє штами вірусу віспяної вакцини з вбудованим антигеном HBs вірусу гепатиту В, антигенів вірусу сказу і кліщового енцефаліту.

Інактивовані корпускулярні вакцини. Містять суспензію убитих (нагріванням, обробкою спиртом, або формаліном і ін.) мікробних клітин, убитих із збереженням імуногенних властивостей і найменшим пошкодженням антигенної структури. Це може бути досягнуто щадним нагріванням (56-58 °С), дією формаліну, спирту, ацетону і ін. До убитих вакцин відносять вакцину проти поліомієлиту (вакцину Солка), грипу, сказу, черевного тифу, холери, чуми, кашлюку і ін.

Аутовакцини – це вакцини, виготовленні з убитих мікробів, які були виділені від хворого, для лікування якого призначений цей препарат.

Анатоксини - це очищені токсини патогенних мікробів, які знешкоджені формаліном і теплом. Такі токсини втратили свої токсичні властивості, але зберегли імуногенні. Анатоксини призначені для створення активного антитоксичного імунітету і для гіперімунізації тваринпродуцентів антитоксичних сироваток (дифтерія, правець, холера).

Хімічні: отримують методом хімічного синтезу або містять імуногенні фракції (протективні антигени) мікроорганізмів. Отримані з мікробів антигени мають досить високу стабільність і їх легше стандартизувати, чим корпускулярні. В даний час використовують хімічні вакцини проти холери, черевного тифу, кашлюку.

Синтетичні: готують з синтетичних антигенів. Основними компонентами таких вакцин є антиген або його детермінанта в молекулярному вигляді, полімерний високомолекулярний носій для додання макромолекулярності антигена і ад’ювант, що неспецифічно підвищує активність антигена.

ДНК-вакцини: є плазмідні (бактерійні) ДНК, в які вбудований ген, кодуючий найбільш важливий для імуногенності вірусний білок. Отримані і випробовуються ДНК-вакцина проти ротавірусної інфекції, гепатиту С, ВІЛ.

Антиідиотипічні: засновані на використанні ідиотипічних детермінант. В даний час розробляється вакцина проти ВІЛ-інфекції.

Вакцинація проводиться з урахуванням епідеміологічної обстановки і медичних протипоказань. До протипоказань відносять гострі захворюван-

95

ня, недавно перенесені інфекційні захворювання, хронічні інфекції (туберкульоз, малярія), пороки серця, важкі ураження внутрішніх органів, друга половина вагітності, при годуванні грудьми.

Фагоцитоз - це найдавніша форма неспецифічного захисту, який є процесом активного поглинання і переварення клітинами організму мікробів або інших сторонніх тіл, які потрапили до нього. Фагоцитами називають клітини організму, які здатні до фагоцитозу. Серед фагоцитів розрізняють професійні і факультативні фагоцити.

До професійних фагоцитів належать нейтрофіли, моноцити крові і макрофаги тканин. Поліморфноядерні нейтрофіли (мікрофаги) забезпечують основний захист організму від патогенних бактерій. Макрофаги (моноцити крові, тканинні макрофаги) є основними клітинами в боротьбі з бактеріями, вірусами. Макрофаги в імунних реакціях виступають як клітини, які презентують антиген, є продуцентами цитокінів, що грають важливу роль в розвитку і регуляції імунних реакцій.

Розпізнавання професійними фагоцитами чужорідних агентів відбувається за допомогою рецептора (неімуноглобулінової природи) з лектінотропними властивостями через антитіла, С3 - комплемент, або через антитіла і С3, які можуть бути фіксовані на чужорідній речовині або на фагоциті.

До факультативних фагоцитів належать фібробласти сполучної тканини, ендотеліоцити синусів селезінки і печінки, ретикулярні клітини кісткового мозку, селезінки, лімфатичних вузлів, еозинофіли крові. Ці клітини мають слабку фагоцитарну активність і на своїй поверхні не несуть рецепторів до антитіл і С3 - комплементу.

В процесі фагоцитозу розрізняють три стадії:

1 стадія - адгезії частин або молекул на фагоциті; 2 стадія - поглинання, коли тверді і розчинні частинки поглинаються

клітиною утворюючи фагосому, яка у свою чергу зливається з лізосомами клітини, утворюючи фаголізосому.

3 стадія - стадія переварення.

Для руйнування поглинених мікробів і вірусів фагоцитуючі клітини використовують киснезалежні і незалежні механізми. У разі дії киснезалежного механізму знищення поглинених об'єктів відбувається в результаті впливу на них надпероксидних аніонів (О2-), пероксиду водню (Н2О2), гідроксильних радикалів. При киснезалежному механізмі знищення мікробних клітин відбувається за рахунок протеїназного ефекту. В цьому випадку руйнування бактерій відбувається шляхом розщеплювання мукопептидів їх стінки катіонними білками і лізоцимом.

Фагоцитовані мікроби під впливом бактерицидних систем в більшості випадків гинуть усередині фагоцита. Процес, який супроводжується заги-

96

беллю бактерій, називається завершеним фагоцитозом. В деяких випадках поглинені мікроорганізми в результаті пониженої бактерицидної активності фагоцитів або високої стійкості мікробів до дії бактерицидних чинників можуть виживати і активно розмножуватися усередині фагоцитів, чим обумовлюють хронічне запалення або хронічний хід інфекції. Це явище отримале назву незавершеного фагоцитозу. Спостерігається воно при туберкульозі, бруцельозі, туляремії, гонореї і інших інфекціях.

Конкретні цілі:

1.Вивчення класифікації вакцин.

2.Принципи отримання різних вакцин.

3.Використання вакцин для профілактики і лікування інфекційних

хвороб.

4.Вивчення ролі клітинних імунних чинників організму від інфекційних агентів.

5.Правильно інтерпретувати результати фагоцитозу при проведенні лабораторної діагностики інфекційних захворювань.

Уміти:

1.Правильно визначати стадії фагоцитозу.

2.Інтерпретувати результати фагоцитозу при проведенні лабораторної діагностики інфекційних захворювань.

Теоретичні питання:

1.Поняття про активний штучний набутий імунітет.

2.Вакцинопрофілактика інфекційних хвороб.

3.Види вакцин. Вимоги до вакцин і шляхи їх введення.

4.Вакцинотерапія інфекційних захворювань.

5.Поняття про фагоцитоз.

6.Види фагоцитарних клітин.

7.Стадії фагоцитозу. Завершений і незавершений фагоцитоз

8.Зв'язок клітинного і гуморального імунітету.

9.Використання фагоцитозу для лабораторної діагностики.

Практичні завдання, які виконуються на занятті:

1.Вивчають стадії фагоцитозу в мікропрепаратах під імерсійним мікроскопом.

2.Інтерпретують результати завершеного і незавершеного фагоци-

тозу.

3.Замальовують стадії фагоцитозу в альбом.

Література:

1.Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – Київ: Віща школа, 1992. – 431 с.

2.Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкова Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. – М.: Медицина, 1998. – 336 с.

97

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.–

М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– 768 с.

2. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 691 с.

5. Конспект лекцій.

Додаткова література:

1.Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка. – Київ: Медицина, 2004. – С. 300-333.

2.Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – Ха-

рьков, 1986. – 125 с.

3.Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии. – Харків, 2005. – 28 с.

Короткі методичні вказівки для роботи на практичному занятті:

На початку заняття проводиться перевірка рівня підготовки студентів до заняття.

Самостійна робота складається з вивчення колекції вакцин і спостережень стадій фагоцитозу в мікропрепаратах, інтерпретації результатів завершеного і незавершеного фагоцитозу. До складу самостійної роботи входить зарисовка демонстраційних препаратів.

В кінці заняття проводиться тестовий контроль і аналіз результатів самостійної роботи кожного студента.

Цільові навчальні завдання:

1.У зв'язку з випадком дифтерії виникла необхідність провести профілактичні щеплення в студентській групі. Який препарат потрібно використовувати для створення штучного активного імунітету?

2. З наближенням епідемії грипу районний епідеміолог складає заяву на профілактичні препарати. Який з них сприяє формуванню активного специфічного імунітету і є найменш реактогенним?

E. Лейкоцитарний інтерферон

3. Для створення активного імунітету у людини використовуються численні вакцинні препарати. Який препарат представлений живими атену-

E. Вакцина проти гепатиту А

4. Після проникнення в організм бактерії фагоцитуються макрофагами. Яку роль грають макрофаги в кооперації імунокомпетентних клітин на

C.Забезпечують процесинг і презентацію антигена Т-хелперам

D.Продукують імуноглобуліни

E.Забезпечують процесинг і презентацію антигена Т-кілерам.

5.Який з перерахованих імунних препаратів призначений для створення антитоксичного імунітету?

A. Протидифтерійна антитоксична сироватка B. Протигрипозний γ -глобулін

C. Анатоксин дифтерійний D. Протикоровий γ -глобулін E. Сироватка лептоспірозна

6.З матеріалу, узятого від хворого з підозрою на гонорею, був приготований мазок із уретри і забарвлений за Грамом. Усередині лейкоцитів були знайдені грамнегативні диплококи. Як правильно називається це явище?

7. Для профілактики якого захворювання використовують живу вакци-

Алгоритм лабораторної роботи:

1.Сучасні уявлення про механізм імунної відповіді.

2.Визначення поняття “вакцини”.

3.Класифікація вакцин.

4.Принцип і загальна процедура виготовлення вакцин різних типів.

5.Переваги і недоліки вакцин живих і інактивованих.

6.Вимоги до вакцин.

7.Вивчення механізму дії вакцин.

8.Протипоказання до застосування вакцин.

9.Визначення поняття “фагоцитоз”.

10.Властивості і функції фагоцитів.

11.Ознайомлення зі стадіями фагоцитозу в мікрослайдах.

12.Оформлення протоколу.

99

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ ДЛЯ СТУДЕНТІВ ДО ПРАКТИЧНОГО ЗАНЯТТЯ № 22

Тема: Генетика мікроорганізмів.

Мета: Ознайомлення з генетичними методами досліджень і їх практичним використанням в мікробіології і біотехнології.

Модуль 1. Морфологія і фізіологія мікроорганізмів. Інфекція. Імунітет.

Змістовний модуль 6. Генетика мікроорганізмів. Еволюція і класифікація мікроорганізмів.

Тема заняття 22. Генетика мікроорганізмів.

Актуальність теми. Вчення про спадковість і мінливість організмів було засноване Ч. Дарвіном в 1859 р.

Генетика мікроорганізмів складає основу молекулярної біології. Найбільш важливі проблеми молекулярної генетики вивчаються на мікроорганізмах.

Ядерні структури бактерій мають характерні морфологічні ознаки, такі, що відрізняють їх від ядер еукаріотичних клітин: їх утворюють так звані хроматинові тільця або нуклеоїди, позбавлені оболонки і що включають майже всю ДНК бактерій. Ядерні структури можна спостерігати у фазово-контрастному мікроскопі, де вони виглядають як менш щільні ділянки цитоплазми.

Мінливість мікроорганізмів підрозділяють на:

1)неспадкову (модифікаційну);

2)спадкову, таку, що викликається мутаціями і генетичними рекомбинаціями генів.

Модифікація - це мінливість, яка викликана дією чинників зовнішнього середовища і що не робить впливу на розвиток. Наприклад, дефіцит кальцію в середовищі викликає підвищене спороутворення і слизистий ріст у бактерій сибірської виразки. Зменшення кількості кисню знижує ступінь пігментації і збільшує число гладких колоній у мікобактерій туберкульозу.

Зміни, що з'являються в результаті модифікації, можуть бути стабільними і лабільними. У ряді випадків ознаки, що індукуються чинниками зовнішнього середовища, можуть зберігатися протягом декількох поколінь.

Під впливом несприятливих умов існування окремі види бактерій зазнають глибокі зміни з формуванням своєрідних дрібних колоній (L- колоній) з темним щільним центром і більш пухкою периферією. L-форми бактерій виникають в результаті порушення синтезу клітинної стінки,

100