1 модуль Микробиология

2. Реакція преципітації (РП) - осадження комплексу антиген-антитіло. Основною відмінністю РП від РА є те, що при РА застосовується корпускулярний антиген, а при РП - антиген є колоїдною речовиною білкової або полісахаридної природи. У цій реакції антиген називається преципітиноген, а антитіла - преципітини. Реакцію ставлять в пробірках нашаруванням розчину антигена на імунну сироватку. При оптимальному співвідношенні антигена і антитіл на межі цих розчинів утворюється кільце преципітату. Якщо як антиген використовують прокип'ячені і профільтровані екстракти органів і тканин, реакція називається реакцією термопреципітації (реакція Асколі, яку ставлять при діагностиці сибірської виразки і ін.).

Широкого поширення набули реакції преципітації в агарі: метод простої дифузії, метод подвійної дифузії.

Різновидом преципітації є реакція флокуляції - для визначення активності анатоксина або антитоксичної сироватки. Крім того, можна використовувати цю реакцію для визначення токсигенності штамів

Corynebacterium diphtheriae.

Конкретні цілі:

1.Пояснити роль антигенів, як індукторів імунної відповіді;

2.Описати структуру антигенів, зокрема антигенів мікроорганізмів;

3.Описати структуру антитіл (різних класів імуноглобулінів);

4.Проаналізувати механізм взаємодії антитіл з антигенами;

5.Описати механізм реакції аглютинації;

6.Описати механізм реакції преципітації.

Уміти:

1.Пояснити роль антигенів, як індукторів імунної відповіді;

2.Описати структуру антитіл (різних класів імуноглобулінів);

3.Проаналізувати механізм взаємодії антитіл з антигенами;

4.Трактувати результати реакції аглютинації;

5.Трактувати результати реакції преципітації;

6.Аналізувати отримані результати.

Теоретичні питання:

1.Визначення поняття «антигени», «антитіла».

2.Роль антигенів як індукторів імунної відповіді.

3.Структура антитіл (різних класів імуноглобулінів).

4.Механізм взаємодії антитіл з антигенами.

5.Реакції імунітету, їх роль в імунній відповіді і діагностиці інфекційних хвороб. Механізм реакції аглютинації і реакції преципітації.

Практичні завдання, які виконуються на занятті:

1.Постановка реакції аглютинації для виявлення антитіл в сироватці хворого.

71

2.Постановка реакції мікроаглютинації на склі з діагностичними сироватками для ідентифікації чистої культури бактерій.

3.Оцінка результатів реакції аглютинації.

4.Постановка реакції преципітації для виявлення антигена бактерій.

5.Оцінка результатів реакції преципітації.

6.Оцінка результатів реакції непрямої гемаглютинації.

7.Оформлення протоколу.

Література:

1.Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – Київ: Віща школа, 1992. – 431 с.

2.Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкова Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. – М.: Медицина, 1998. – 336 с.

3.Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.–

М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– 768 с.

2.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 691 с.

5.Конспект лекцій.

Додаткова література:

1.Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка. – Київ: Медицина, 2004. – С. 300-333.

2.Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – Ха-

рьков, 1986. – 125 с.

3.Сборник тестовых заданий для самоподготовки по медицинской микробиологии и вирусологии. – Харків, 2005. – 28 с.

Короткі методичні вказівки для роботи на практичному занятті.

На початку заняття проводиться перевірка рівня підготовки студентів до заняття. Самостійна робота складається з:

а) постановки реакції аглютинації для виявлення антитіл в сироватці хворого і оцінки результатів реакції;

б) постановки реакції мікроаглютинації на склі і оцінки результатів реакції;

в) постановки реакції преципітації і оцінки результатів реакції; г) оцінки результатів реакції непрямої гемаглютинації.

Після аналізу результати реакцій записують в протокол.

В кінці заняття проводиться оформлення протоколу, тестовий контроль і аналіз результатів самостійної роботи кожного студента.

Цільові навчальні завдання:

1.На шкіряно-оброблювальний завод доставили шкіру тварин з району, де реєструється сибірська виразка. Яка з приведених реакцій викорис-

72

товується для виявлення термостабільного антигена збудника сибірської

2. При дослідженні імунологічного стану визначається наявність в сироватці всіх класів імуноглобулінів. Яких з перерахованих імуноглобулі-

3. На базарі громадянин А. продавав ковбасу під назвою «свина домашня». У держсанінспекції виникла підозра на фальсифікацію ковбаси. За допомогою якої серологічної реакції імунітету можна ідентифікувати хар-

4. З метою серологічної діагностики кашлюку поставлена реакція з кашлюковим і паракашлюковим діагностикумами. На дні пробірок, в які був внесений діагностикум з Bordetella parapertusis, утворився зернистий

5. Щоб визначити токсигенність виділених від пацієнтів збудників дифтерії, культури висівали на чашку Петрі з живильним середовищем з двох сторін від розташованого в центрі смужки фільтрувального паперу, змоченого протидифтерійною антитоксичною сироваткою. Після інкубації посівів в агарі між окремими культурами і смужкою фільтрувального паперу виявлені ділянки помутніння середовища. Яку серологічну реак-

Алгоритм лабораторної роботи:

1.Постановка реакції аглютинації для виявлення антитіл в сироватці хворого.

2.Оцінка результатів реакції аглютинації.

3.Постановка реакції мікроаглютинації.

4.Оцінка результатів реакції мікроаглютинації на склі.

5.Постановки реакції преципітації.

6.Оцінка результатів реакції преципітації.

7.Оцінка результатів реакції непрямої гемаглютінації.

8.Запис схем реакцій і висновків у протокол.

9.Оформлення протоколу.

10.Тестовий контроль і аналіз результатів самостійної роботи кожного студента.

73

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ ДЛЯ СТУДЕНТІВ ДО ПРАКТИЧНОГО ЗАНЯТТЯ № 17

Тема: Реакції імунітету: реакція зв’язування комплементу, реакція лізису.

Мета: Оволодіння технікою постановки реакції зв’язування комплементу і реакції лізису.

Модуль 1. Морфологія і фізіологія мікроорганізмів. Інфекція. Імунітет.

Змістовний модуль 5. Реакції імунітету.

Тема заняття 17. Реакція зв’язування комплементу. Реакція лізису. Актуальність теми. Не дивлячись на значну кількість загальноприйнятих методів діагностики, більшість з них за точністю, надійністю і чутливістю не повною мірою відповідають сучасним вимогам. Це пов'язано з біологічними особливостями ряду збудників, що обмежує застосування бактеріологічних і вірусологічних методів, і примушує дослідників вести

розробку нових ефективніших діагностичних методів.

У зв'язку з цим останніми роками розроблений ряд імунологічних тестів, які відрізняються високою чутливістю і специфічністю, а також швидкістю отримання результату. До таких досліджень відносяться полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), імуноферментний аналіз, реакція імуноблотінга, імунохроматографічний аналіз і ін. Успіх серологічної діагностики залежить від специфічності реакції і дотримання умов узяття крові за часом, необхідних для синтезу організмом антитіл.

Взаємодія антигена з антитілом викликає ряд строго специфічних явищ у вигляді феноменів, доступних для спостереження в пробірках і що знайшли практичне застосування в лабораторній діагностиці у вигляді імунологічних реакцій.

Широке застосування в лабораторній діагностиці інфекційних хвороб мають, на ряду з іншими, класичні реакції: реакція зв’язування комплементу, реакція лізису.

Реакції імунітету використовуються при діагностичних і імунологічних дослідженнях у хворих і здорових людей. З цією метою застосовують серологічні дослідження (від лат. serum - сироватка + logos - учення) - методи вивчення антитіл і антигенів за допомогою реакцій антигенантитіло в сироватці крові і інших рідинах, а також тканинах організму.

До основних серологічних реакцій відносяться реакції аглютинації, преципітації, лізису, нейтралізації, реакції за участю комплементу, з використанням мічених антитіл і антигенів (радіоімунологічний, імуноферментний, імунофлюоресцентний). Перераховані реакції відрізняються по

74

реєстрованому ефекту і техніці постановки, проте всі вони засновані на реакції взаємодії антигена з антитілом і застосовуються як для виявлення антитіл, так і антигенів.

Реакції за участю комплементу засновані на активації комплементу в результаті приєднання його до антитіл, що знаходяться в комплексі з антигеном.

Реакцію зв’язування комплементу (РЗК) проводять у дві фази:

1-а фаза - інкубація суміші шуканого антигена (або антитіла) з діагностичною сироваткою (або антигеном-діагностикумом) і комплементом;

2-а фаза - індикаторна - визначення наявності в суміші вільного комплементу додаванням гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана і гемолітичної сироватки, що містить антитіла до еритроцитів барана. У 1-ій фазі реакції при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається зв’язування ним комплементу, в 2-ій фазі гемоліз сенсибілізованих антитілами еритроцитів відсутній (реакція позитивна). При негативній реакції, якщо антиген і антитіло не відповідають один одному, комплемент залишається вільним і в 2-ій фазі реакції він приєднується до комплексу еритроцит-антиеритроцитарне антитіло гемолітичної сироватки, викликаючи гемоліз.

РЗК застосовують для діагностики багатьох інфекційних хвороб, зокрема сифілісу (реакція Вассермана).

Реакцією лізису називається розчинення антигена, сполученого з антитілами, у присутності комплементу. Лізини (антитіла, що беруть участь в реакції) проявляють дію тільки у присутності комплементу.

Специфічні антитіла взаємодіють з різними клітинами, зокрема бактеріями і найпростішими, що приводить до активації системи комплементу за класичним шляхом і подальшогоу лізису клітин. Серед них відомі реакції вібріолізу і реакції гемолізу.

Більшість мікроорганізмів, за винятком холерного вібріона і трепонем, стійкі до літичної дії антитіл. Тому реакція лізису не знайшла широкого застосування в лабораторній практиці.

Реакцію лізису використовують як індикаторну систему в реакції зв’язування комплементу.

Для постановки реакції лізису і РЗК використовують комплемент, який міститься в сироватці крові морських свинок.

Конкретні цілі:

1.Пояснити цінність реакції зв’язування комплементу (РЗК) в діагностиці інфекційних хвороб.

2.Пояснити інгредієнти, необхідні для постановки РЗК.

3.Пояснити механізм РЗК.

4.Пояснити облік РЗК.

75

5.Відзначити особливості реакції Вассермана при сифілісі і РЗК в модифікації Фізе при рикетсіозах).

6.Пояснити реакцію бактеріоліза (феномен Ісаєва-Пфейфера).

Уміти:

1.Поставити РЗК.

2.Пояснити механізм РЗК.

3.Провести облік реакції.

4.Пояснити феномен Ісаєва-Пфейфера.

Теоретичні питання:

1.Суть РЗК. Необхідність використання індикаторної системи.

2.Характеристика і підготовка інгредієнтів РЗК.

3.Механізм РЗК.

4.Практичне використання РЗК, реакції бактеріоліза.

Практичні завдання, які виконуються на занятті:

1.Титрація комплементу для РЗК за допомогою реакції гемолізу (титр

комплементу, робоча доза).

2.Постановка РЗК.

3.Облік РЗК.

4.Вивчення реакції бактеріоліза Ісаєва-Пфейфера (за таблицею).

5.Оформлення протоколу.

Література:

1.Пяткін К.Д., Кривошеїн Ю.С. Мікробіологія з вірусологією та імунологією. – Київ: Віща школа, 1992. – 431 с.

2.Воробьев А.В., Быков А.С., Пашкова Е.П., Рыбакова А.М. Микробиология. – М.: Медицина, 1998. – 336 с.

3.Медицинская микробиология /Под редакцией В.И. Покровского.–

М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.– 768 с.

4.Медицинская микробиология, вирусология и иммунология /Под редакцией академика А.А. Воробьева. – М.: Медицинское информационное агентство, 2004. – 691с.

5.Конспект лекцій.

Додаткова література:

1.Збірник завдань для підготовки до тестового екзамену Крок-1. Загальна лікарська підготовка. – Київ: Медицина, 2004. – С. 300-333.

2.Методические указания для преподавателей к практическим занятиям по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. – Харь-

ков, 1986. – 125 с.

Короткі методичні вказівки для роботи на практичному занятті.

На початку заняття проводиться перевірка рівня підготовки студентів до заняття. Самостійна робота полягає в:

76

а) постановці реакції зв’язування комплементу, оцінці результатів реакції;

б) розборі реакції бактеріоліза Ісаєва-Пфейфера (за таблицею). Після аналізу результати реакцій записують в протокол.

В кінці заняття проводиться оформлення протоколу, тестовий контроль і аналіз результатів самостійної роботи кожного студента.

Цільові навчальні завдання:

1.Гемолітична сироватка проти еритроцитів барана необхідна для роботи в лабораторії, де проводиться серологічна діагностика інфекційних хвороб. Для чого її використовують?

А. Для визначення видової приналежності еритроцитів в судовомедичній експертизі

В. Для реакції непрямої гемаглютинації С. Для діагности гемолітичної хвороби новонароджених при резус-

конфлікті

D. Для реакції гальмування гемаглютинації

Е. Как компонент гемолітичної системи в реакції зв’язування комплементу

2.Для серологічної діагностики сифілісу з використанням реакції Вассермана лікар-лаборант підготував наступні реактиви: кардіоліпіновий антиген; спиртовий екстракт ліпідів з серцевого м'яза бика з холестерином; антиген з трепонем, зруйнованих ультразвуком; гемолітичну систему; ізотонічний розчин натрію хлориду; досліджувані сироватки. Який ще компонент необхідний для постановки цієї реакції?

Е. Діагностична преципітуюча сироватка 3. В жіночу консультацію прийшла жінка на 8 тижні вагітності. При

обстеженні у неї узяли кров для перевірки на наявність специфічних антитіл до трепонем. Які з перерахованих нижче серологічних реакцій можуть

4. В дермато-венерологічному диспансері з метю діагностики сифілісу застосовується реакція Вассермана. До якого з приведених типів реакцій

5. При додаванні гемолітичної (індикаторної) системи до пробірок з бактерійною системою в останніх відбувся гемоліз. Про яку реакцію йде

6.При постановці РЗК в пробірці з досліджуваною сироваткою хворого в системі утворився комплекс антиген-антитіло-комплемент, не визначуваний візуально. Яким чином можна виявити цей комплекс антиген- антитіло-комплемент?

А. Використовуючи індикаторну тест-систему В. Заразивши кролика С. Додавши 3%-у суспензію еритроцитів

D. Додавши гемолітичну сироватку Е. Додавши фізіологічний розчин

7.При постановці РЗК з сироваткою хворого з підозрою на хронічну гонорею, вона виявилася позитивною на 4 хрести у всіх розведеннях сироватки (від 1:5 до 1: 160). Як можна визначити візуально феномен позитивної РЗК на 4 хрести?

А. Наявність осаду і безбарвної надосадової рідини

8. Відомо, що на кожен збудник хвороби в організмі людини утворюються антитіла: аглютиніни, преципітини, опсоніни, лізини, комплементзв’язуючі та інші. У якій серологічній реакції можна виявити ком-

9. Після проникнення в організм бактерії фагоцитуються макрофагами. Яку роль грають макрофаги в кооперації імунокомпетентних клітин на першому етапі формування імунної відповіді?

A. Активують NK-клітини B. Активують Т-кілери

C.Забезпечують процесинг і презентацію антигена Т-хелперам

D.Продукують імуноглобуліни

E.Забезпечують процесинг і презентацію антигена Т-кілерам

Алгоритм лабораторної роботи:

1. Титрація комплементу для РЗК за допомогою реакції гемолізу (титр

комплемента, робоча доза).

2.Постановка РЗК.

3.Оцінка результатів РЗК.

4.Вивчення бактеріоліза на прикладі реакції Ісаєва-Пфейфера (за таблицею).

5.Запис схем реакцій і висновків в протокол.

6.Оформлення протоколу.

7.Тестовий контроль і аналіз результатів самостійної роботи кожного студента.

78

МЕТОДИЧНІ ВКАЗІВКИ ДЛЯ СТУДЕНТІВ ДО ПРАКТИЧНОГО ЗАНЯТТЯ № 18

Тема: Вчення про імунітет. Серологічні реакції з міткою. Мета: Вивчити механізм постановки серологічних реакцій з мітками і полімеразної ланцюгової реакції для експресдіагностики інфекційних захворювань.

Модуль 1. Морфологія і фізіологія мікроорганізмів. Інфекція. Імунітет.

Змістовний модуль 5. Реакції імунітету. Імунопатологія.

Тема заняття 18. Серологічні реакції з міткою. Полімеразна ланцюгова реакція.

Актуальність теми. Методи імунохімічного аналізу, засновані на специфічному зв’язуванні визначуваної сполуки відповідними антитілами, широко увійшли до аналітичної практики і використовуються в різних областях медицини, сільського господарства, мікробіологічної і харчової промисловості, для цілей охорони навколишнього середовища. Індикація комплексу, що утворюється, антиген-антитіло, може бути здійснена, якщо в один з початкових компонентів реакційної системи ввести мітку, яка легко детектується відповідним високочутливим фізико-хімічним методом. Вельми зручними для цієї мети виявилися ізотопні, ферментні, флуоресцентні, парамагнітні і ін. мітки, використання яких дало можливість збільшити чутливість класичних методів імунохімічного аналізу в мільйони разів, а час аналізу зменшити до декількох хвилин.

Історично першим серед них був радіоімунологічний аналіз (РІА), запропонований в кінці 50-х років минулого століття. Завдяки можливості визначати мітку, якою був ізотоп 125I, в дуже малих концентраціях, вдалося досягти високої чутливості аналізу (на рівні пкг/мл).

Радіоімунний метод є найбільш інформативним, заснований на дослідженні характеру взаємодії антитіла з антигеном з утворенням імунного комплексу, в один з компонентів якого (антиген або антитіло) введена радіоактивна мітка. Найбільшого поширення набув метод конкуренції за специфічні антитіла міченого радіоактивним ізотопом антигена і такого ж антигена, але вільного від радіоактивної мітки, кількість якого необхідно визначити в досліджуваному біологічному середовищі. З цією метою в досліджувану рідину, в якій передбачається наявність антигена, додають відому кількість такого ж міченого антигена і стандартну кількість антисироватки з відповідними антитілами. Якщо в досліджуваній рідині відсутній шуканий специфічний антиген, то близько 70-80 % міченого антигена зв'язується з антитілами, обумовлюючи високу радіоактивність преципі-

79

тату, що утворюється. Якщо ж в біологічному середовищі присутній шуканий антиген, він конкурує з міченим антигеном і зв'язує частину антитіл. В результаті радіоактивність преципітату падає в порівнянні з контролем. На цьому принципі засновано кількісне визначення антигенів або антитіл. Оскільки мічений антиген додається в певній дозі, то можна визначити, яка його частина зв'язалася з антитілами, а яка залишилася не зв'язаною в результаті конкуренції з не міченим антигеном, що виявлявся. При певних концентраціях кількість міченого антигена, що зв'язався з антитілами, зворотно пропорційна до кількості визначуваного антигена. Після взаємодії антигенів із антитілами комплекси антиген - антитіло відокремлюють від вільного міченого антигена. Способи відділення: 1. Електрофорез; 2. Гель - фільтрації; 3.Фракційного осадження імунного комплексу етанолом і ін. Відокремивши мічений антиген від комплексу антиген - антитіло визначають кількість міченого антигена, що зв'язався в комплексі за кількістю імпульсів (сцинтиляційним лічильником). Зменшення кількості імпульсів в одиницю часу порівняно з відповідними контролями свідчить про присутність гомологічного міченого антигена, по- в'язаного з антисироваткою, внаслідок чого антиген не вступив у реакцію

іне визначається в комплексі антиген - антитіло.

Всередині 60-х років для ідентифікації і локалізації антигенів в гістохімічних препаратах і виявлення смуг преципітації в імунодіфузних і імуноелектрофоретичних методах як високочутливу мітку було запропоновано використовувати молекули ферментів. Будучі за своєю природою могутніми хімічними каталізаторами, ферменти здатні ефективно здійснювати утворення продукту, що легко детектується, що робить можливим визначення ферментної мітки у вельми малих концентраціях.

Впродовж останніх трьох десятиліть імуноферментні методи аналізу інтенсивно розвивалися як в теоретичному, так і практичному плані і до теперішнього часу вони сформувалися в самостійний науковий напрям, що має важливе прикладне значення. Найбільшого поширення набули гетерогенні методи імуноферментного аналізу, засновані на використанні планшетів полістиролів для імобілізації антитіл або антигенів, специфічному зв’язуванні визначуваної речовини на стінках лунок планшета і подальшому виявленні імунокомплексів, що утворилися, за допомогою мічених ферментами компонентів.

Імуноферментний метод заснований на обліку реакції антигенантитіло, причому як мітка, що дозволяє виявити імунний комплекс, використовують ферменти, наприклад пероксидазу, лужну фосфатазу. Одним із поширених варіантів теста ІФА є твердофазний метод «Сендвіч - метод»: спочатку на стінках полістиролових пробірок сорбують антитіла проти певного антигена. У цю ж пробірку вносять досліджуваний біологі-

80