1. В эпидерме:

• количество слоев;

• наличие устьиц и тип устьичного аппарата, их количество на единицу площади;

• размеры эпидермальных клеток на поперечных и продольных срезах;

• характер утолщения оболочки (вся ли утолщена или отдельные стен­ки, утолщение равномерное или нет);

• форму клеток на поперечном срезе;

• наличие и тип трихом;

• продолжительность жизни.

2. В перидерме:

• наличие составных тканей (феллемы, феллодермы, феллогена, так как феллодерма часто может отсутствовать);

• ширину феллемы;

• количество клеток феллемы в радиальном ряду в границах годичного слоя;

наличие годичных слоев;

• структуру (гомо- или гетерогенная);

• наличие содержимого в клетках феллемы и других тканей;

• наличие хлоропластов, идиобластов, кристаллов;

• форму очертаний клеток на всех срезах;

• наличие утолщений оболочки и характер утолщения;

• размеры клеток.

В феллодерме обычно отмечают ее ширину, сложение, форму клеток.

3. В колленхиме:

• отмечают ее наличие или отсутствие, тип;

• ширину ткани на поперечном срезе;

• наличие в клетках хлоропластов, кристаллов;

• возрастные изменения (склерификация);

• отличие от прилегающих клеток феллодермы и паренхимы первичной коры.

4. В паренхиме первичной коры – (обычно это наиболее развитая ткань молодых стеблей) необходимо отметить:

• форму клеток на поперечном и продольном срезах;

• характер (гомо- или гетерогенная);

• сложение (плотное, рыхлое с хорошо развитой сетью межклетников);

наличие идиобластов;

• наличие, форма, размер, локализация кристаллов оксалата кальция;

• наличие млечников, смолоносной системы;

• наличие склереид.

5. В первичной флоэме:

- расположение (сплошным кольцом, участками);

- гистологический состав.

6. Во вторичной флоэме:

• гистологический состав;

• соотношение тканей;

• характер расположения аксиальной паренхимы;

• наличие механических элементов и их расположение;

• дифференциацию на проводящую, непроводящую, дилатационную зоны;

• тип и локализацию кристаллов оксалата кальция;

• форму поперечного сечения ситовидных элементов;

• тип ситовидных пластинок и форму ситовидных полей.

7. Во вторичной ксилеме:

• тип (рассеянно-сосудистая, кольцесосудистая или переходного типа);

• рисунок расположения просветов сосудов и их количество на единицу площади;

• форму поперечного сечения сосудов;

• наличие трахеид, волокнистых трахеид, либриформа;

• толщину стенок;

• тип перфорации и межсосудистой поровости и сосудов;

• тип сердцевинных лучей, их структуру, наличие в них идиобластов, оксалата кальция;

• выраженность годичной слоистости.

Методика описания вторичной ксилемы очень подробно дана в книге А.А. Яценко-Хмелевского (1954), которую каждому исследователю необходимо проработать весьма тщательно.

Сравнительный анализ может быть выполнен в следующих двух аспектах:

1. Сравнение структур органов представителей разных таксонов (видов, родов, семейств), при этом больше внимания уделяется качественным признакам, не подверженных влиянию среды, и количественным характеристикам: тип и форма ситовидных пластинок, тип лучей, форма и место локализации оксалата кальция, тип древесины, гистологический состав тканей, выраженность годичной слоистости и т.д.

2. Сравнение представителей одного вида в зависимости от условий произрастания. Сейчас уже установлено, что ни естественные, ни антропогенные факторы практически не влияют на качественные признаки, а значит, большее внимание уделяется количественным. Производят отбор параметров, по которым сравнивают образцы и осуществляют измерения. Обязательно вычисляется достоверность различия между ними. Только в этом случае можно будет говорить о доказанности или недоказанности влияния фактора.

Если производятся наблюдения за формированием органа, т.е. образцы отбираются через равные промежутки времени в течение вегетационного сезона, то прослеживаются изменения как качественных, так и количественных признаков.

Как мы уже отмечали выше, в сравнительных исследованиях очень важна количественная характеристика объекта и его структур. Для производства измерений под микроскопом необходимо иметь объект-микрометр и окуляр-микрометр. Объект-микрометр – это металлическая пластинка, в которую вмонтировано небольшое стекло с нанесенной штриховой линейкой: 1 линейный мм поделен на 100 делений, т.е. каждое деление соответствует 10 мкм.

Винтовой окуляр-микрометр устанавливают вместо окуляра. В нем вмонтирована стеклянная шкала, имеющая 8 делений. Вдоль шкалы при помощи винта, на котором вмонтирован вращающийся барабан с нанесенными по его окружности делениями (100), перемещается подпружиненный движок. На перемещающемся стекле движка нанесены две линии, перекрещивающиеся под прямым углом и две параллельные линии над местом перекреста.

Прежде чем производить измерение, необходимо определить цену деления шкалы барабана. Она определяется для каждого объектива.

Для определения цены деления вместо постоянного препарата на предметный столик помещают объект-микрометр. Винтовой окуляр-микрометр надевают на тубус вместо окуляра. Установив на резкость линейку объект-микрометра, совмещают крайние штрихи линейки на объект-микрометре и в окуляр-микрометре, затем совмещают две параллельные линии с началом линейки (вращая барабан), при этом «0» вращающегося барабана должен совпасть с неподвижным штрихом. Отводя барабаном параллельные линии от нулевого штриха до совпадения с любым штрихом объект-микрометра (но не на полный оборот) подсчитывают число делений по шкале объект-микрометра до параллельных линий и умножают на 10 (одно деление объект-микрометра равно 10 мкм), и, поделив эту цифру на число делений барабана, на которое он переместился от «0», получают цену деления барабана. Цена деления одного большого деления шкалы окуляр-микрометра равна полному обороту – 100 делениям барабана.

Чтобы измерить величину обьекта под микроскопом, после наведения на резкость, совмещают нулевой штрих с началом обьекта, подсчитывают сколько больших делений линейки уместилось на объекте, а оставшуюся часть измеряют вращением барабана.

Допустим, по диаметру клетки поместилось 2 больших деления (100 делений барабана × 2 = 200), после штриха «2» барабан вращают от нуля до совмещения с концом объекта и отсчитывают число делений по барабану, на которое он переместился. Длина объекта в делениях барабана равна 200 плюс число делений барабана (допустим 25). Общая длина 225 делений барабана. Зная цену деления, умножаем на него длину объекта в делениях, получим длину в микронах.

4.7.5 Статистическая обработка результатов

При описании анатомического строения стебля растений необходимо использовать количественные показатели, но нужно иметь в виду, что они варьируют в очень широких пределах, т.к. процесс роста растений испытывает мощное «давление» экологических факторов. Следовательно, обычные размеры элементов даются в разбеге «от» и «до» (например, диаметр сосудов варьирует в пределах 100-150 мкм).

Обязателен математический аппарат в сравнительных исследованиях: анализ влияния экологических факторов, влияние возраста, видовой принадлежности. В том случае должна осуществляться статистическая обработка. В анатомии растений, как и в целом в биологии, вполне приемлем уровень статистической значимости 5% (W=5), соответственно, доверительный уровень равен 95%.

Для получения необходимого показателя производят 25 измерений и обрабатывают неранжированный вариационный ряд. Среднюю арифметическую вариационного ряда () вычисляют по формуле:

, ( )

где:

– сумма всех вариант ряда;

– объём выборки.

После этого определяют величину колебания значений вариант около их средней арифметической, которое характеризуется средним квадратическим отклонением (). Вместе со средней арифметической () этот показатель используется для вычисления других показателей. Среднее квадратическое отклонение в квадрате () называется дисперсией.

(1).

Этот показатель характеризует рассеянность вариант около .

Для оценки достоверности средней арифметической вычисляется её ошибка:

, (2),

где:

– ошибка средней арифметической;

– среднее квадратическое отклонение.

Достоверность средней арифметической оценивают по критерию Стьюдента:

(3).

Средняя арифметическая считается достоверной, если вычисленное значение выше табличного. Если же оно меньше табличного, это означает, что или недостаточен объём выборки, для которой найдена средняя величина, или данные не однородны.

В результатах обработки среднюю арифметическую приводят вместе с ошибкой:

Среднее квадратическое отклонение характеризует степень отклонения вариант данной совокупности от средней арифметической в абсолютных числах. Однако, для сравнения совокупностей по их вариабельности необходимо вычислить коэффициент вариации (), который показывает, какой процент составляет от средней арифметической:

, % (4).

Если равно:

0-4% – варьирование признака небольшое:

5-44% – варьирование признака нормальное;

45-64% – варьирование признака значительное;

85-104% – варьирование признака очень большое;

более 105% – варьирование признака аномальное.

Важным показателем является точность опыта, который выражает величину ошибки средней арифметической в процентах от самой средней арифметической, т.е. служит показателем точности определения последней:

, или .

Точность опыта считается удовлетворительной, если величина показателя не превышает 5%. При значении более 5%, рекомендуется увеличить число наблюдений или повторностей.

4.7.6 Мацерация

Во многих случаях для получения более полного представления о строении элементов, необходимо проводить мацерацию материала путём разрушения межклеточного вещества, в котором преобладает пектин, что вызывает распад ткани на составляющие её клетки. Можно использовать несколько способов мацерации:

1. Кипячение в воде – используется для мацерации мелких и нежных тканей. Так при кипячении клубней картофеля материал распадается на отдельные клетки.

2. Кипячение материала в течение нескольких минут в едком кали различной концентрации (5-50%) в зависимости от плотности материала. После обработки щёлочью материал промывают водой.

3. Если межклеточное вещество не пропитано или слабо пропитано лигнином, что имеет место у травянистых растений, то применяют способ Мажена. Объект помещают на 24 часа в подкисленную воду или подкисленный спирт (3-5 частей 96% спирта и 1 часть соляной кислоты), после чего объект переносят в 10% раствор аммиака также на 24 часа. После такой выдержки кусочки материала при надавливании пинцетом, кисточкой, иглой легко расчленяются на отдельные клетки. Если расчленение на отдельные структуры происходит с трудом, то используют 30%-ный аммиак. При таком способе мацерации хорошо сохраняется содержимое клетки.

4. Крепкий 30%-ный водный раствор хромового ангидрида. Его используют для мацерации твердого материала (древесина, скорлупа орехов и т.д.). Лезвием опасной бритвы готовят не очень толстые срезы, которые помещают в раствор не более чем на 5 минут, после чего быстро промывают водой. После обработки по этому методу материал легко распадается на элементы.

Необходимо помнить, что объект, подвергаемый мацерации, дол­жен быть однородным. Нельзя мацерировать кусочек, содержащий древесину и флоэму одновременно, т.к. в одном и том же реактиве ткани требуют разной продолжительности воздействия (экспозиции). Пока твердая часть достигает необходимой консистенции, мягкая уже разрушается.

Мацерированный материал можно покрасить эозином, сафранином, гематоксилином. После промывки водой и дегидратации объект можно заключать в канадский бальзам и готовить постоянные препараты.

4.7.7 Реактивы и красители

1. Спирт 96%;

2. Желатин;

3. Дистиллированная вода;

4. Водный синий;

5. Ксилол;

6. Нильский синий;

7. Фенол кристаллический;

8. Уксусно-кислый свинец;

9. Пикриновая кислота;

10. Парафин;

11. Щелочи (КОН, NaOH);

12. Соляная кислота;

13. Глицерин;

14. Аммиак;

15. Канадский бальзам;

16. Хромовый ангидрид;

17. Сафранин;

18. Медный купорос;

19. Двухромовокислый калий (хромпик).