2.4 Природно чиста культура дріжджів

Для засівання сусла в бродильних апаратах використовують дріжджі природно чистої культури, які відрізняються від чистої культури тим, що їх вирощують в умовах обмеженого потрапляння сторонніх мікроорганізмів, розвиток яких пригнічують.

Температура росту сторонніх мікроорганізмів майже не відрізняється від оптимальної температури росту дріжджів та спиртового бродіння, тому бактеріостатичні умови для них створюють зниженням активної кислотності сусла до рН 3,8 – 4,0 за допомогою сірчаної чи молочної кислоти. Хоча ці умови менш сприятливі для розмноження дріжджів, ніж при рН 4,7 – 5,0, вони забезпечують отримання мікробіологічно достатньо чистих культур.

2.5 Розпад вуглеводів

Анаеробний розпад вуглеводів. Ферментативна дисиміляція вуглеводів в анаеробних умовах, що відбувається з виділенням енергії та приводить к утворенню продуктів неповного окислення, називається бродінням. В цьому процесі акцептором водню слугують органічні сполуки, які утворюються в реакціях окислення (наприклад, оцтовий альдегід при спиртовому бродінні); кисень у цих реакціях не бере участі.

Схема хімічних перетворень при спиртовому бродінні описується такими послідовностями:

- утворюються фосфорні етери цукрів. Під впливом ферменту гексокинази та аденілових кислот, що є донорами та акцепторами фосфорної кислоти, глюкоза перетворюється в глюкопіранозо-6-фосфат. Аденілові кислоти в дріжджах містяться у вигляді аденозинмонофосфату (АТФ), адинозиндифосфату (АДФ) та аденозинтрифосфату (АТФ). Гексокиназа каталізує перенос однієї фосфорної групи з АТФ на глюкозу. При цьому АДФ перетворюється в АДФ, а залишок фосфорної кислоти приєднується по місцю розташування шостого вуглецевого атома. Дія ферменту активується йонами мангану. Подібно до цього йде перетворення D-фруктози та D-манози. Глюкокіназна реакція визначає швидкість процесу бродіння.

- глюкозо-6-фосфат під дією ферменту глюкозофосфатизомерази підпадає під вплив ізомеризації – перетворенню в глюкозо-6-фосфат. Реакція зворотна та здвигнута у бік фруктозо-6-фосфату.

- фруктозо-6-фосфат під дією ферменту фосфофруктокинази приєднує по місцю першого вуглецевого атому другий залишок фосфорної кислоти за рахунок АТФ та перетворюється в фруктозо-1,6-дифосфат. Ця реакція практично не зворотна. Молекула цукру переходить до оксоформи та стає лабільною, що має можливість до подальшого перетворення, тому що послаблюється зв'язок між третім та четвертим атомами вуглецю.

- під дією ферменту альдолази (що активується йонами Со²⁺, Са²⁺, Zn²⁺) фруктозо-1,6-дифосфат розпадається на дві фосфотриози – 3-фосфогліцериновий альдегід та фосфодиоксіацетон. Ця реакція зворотня.

- між фосфотриозами відбувається реакція ізомеризації, що каталізується ферментом триозофосфатізомеразою. Рівновага встановлюється при 95% 3-фосфогліцеринового альдегіду та 5% фосфодіоксиацетону.

- в індукційний період, поки що в якості проміжного продукту не утворюється оцтовий альдегід, між двома молекулами 3-фосфогліцеринового альдегіду під впливом ферменту альдегідмутази при участі молекули води проходить реакція дисмутації. При цьому одна молекула фосфогліцеринового альдегіду відновлюється, та утворюється фосфогліцерин, друга окислюється в 3-фосфогліцеринову кислоту. Фосфогліцерин у подальших реакціях не бере участі та після відщеплення фосфорної кислоти являється побічним продуктом спиртового бродіння.

При встановленому процесі окислення 3-фосфогліцеринового альдегіду в 3-фосфогліцеринову кислоту проходить складним шляхом. Спочатку він перетворюється в 1,3-дифосфогліцериновий альдегід, приєднуючи залишок неорганічної фосфорної кислоти, після цього під дією ферменту триозофосфатдегідрогенази у присутності НАД (нікотинамідаденіндинуклеотиду) окислюється в 1,3-дифосфогліцеринову кислоту. НАД, коли вступає в реакцію зі специфічним білком, утворює анаеробну дегідрогеназу, яка має властивість віднімати водень безпосередньо від фосфогліцеринового альдегіду та інших органічних сполук.

- при участі ферменту фосфотрансферази залишок фосфорної кислоти, що містить макроенергетичний зв'язок, передається з 1,3-дифосфогліцеринової кислоти на АДФ з утворенням АТФ та 3-фосфогліцеринової кислоти. Енергія, що звільнюється при окисленні фосфогліцеринового альдегіду, резервирується в АТФ.

- під дією ферменту фосфогліцеромутази 3-фосфогліцеринова кислота ізоиерується в 2-фосфогліцеринову кислоту.

- в результаті віддавання води, що викликано перерозподілом внутрішньої енергії, 2-фосфогліцеринова кислота перетворюється у фосфоенолпіровіноградну кислоту, яка містить макроенергетичний зв'язок. Реакцію каталізує енолаза, що активується йонами Mn²⁺, Mg²⁺, Zn²⁺.

Максимальна дія енолази виявляється в інтервалі рН 5,2 -5,5. При рН 4,2 молекули енолази агрегуються, при рН 3 – 4 денатурується не зворотно.

- під дією ферменту фосфотрансферази у присутності йонів К⁺ залишок фосфорної кислоти передається від фосфоенолпіровіноградної кислоти на АДФ, резервуя енергію в АТФ.

- енолпіровіноградна кислота, що утворилася, перетворюється у більш стабільну форму.

- під дією ферменту карбоксилази від піровіноградної кислоти відщеплюється діоксид вуглецю та утворюється оцтовий альдегід.

- фермент алкогольдегідрогеназа переносить водень з відновленого НАД^. Н₂ на оцтовий альдегід, в результаті чого утворюється етиловий спирт та регенерується НАД.

Загальна схема спиртового бродіння наведена на рисунку 2.2

Рисунок 2.2 – Біохімічна схема спиртового бродіння

Аеробний розпад вуглеводів.

В умовах аеробіозу розпад вуглеводів до утворення піровіноградної кислоти відбувається так само, як і при анаеробіозі, але на відміну від його піровіноградна кислота повністю окисляється до діоксиду вуглецю й води в циклі трикарбонових кислот ЦТК (циклі Кребса). У цьому циклі послідовно протікають окислювально-відновні реакції, у яких під дією специфічних дегідрогеназ відбувається переніс водню на молекулярний кисень (кінцевий його акцептор). Однак перенос здійснюється не безпосередньо, а через молекули переносники, що утворять так званий дихальний ланцюг.

Схема хімічних перетворень при аеробному розпаді представлена на рисунку 2.3

При катаболізмі глюкози утворяться дві молекули піровіноградної кислоти. Спочатку одна з них піддається реакціям окисного декарбоксилірування, у результаті яких утвориться ацетил-КоА (активована оцтова кислота):

СН_З - СООН + КоАSН + НАД = СН₃ - СО - КоAS + НАД - Н₂ + СO₂.

Рисунок 2.3. Цикл трикарбонових кислот:

1- цитратконденсуючий фермент; 2- аконітаза; 3 - ізоцитратдегідрогеназа; 4 - кетоглутаратдегідрогеназа; 5 - сукцинатілокіназа; 6 - сукцинатдегідрогеназа; 7 - фумараза; 8 – малатдегідогеназа.

Друга молекула піровіноградной кислоти під дією ферменту піруваткарбоксілази конденсується з молекулою діоксиду вуглецю з утворенням щавлево-оцетової кислоти:

СН_З - СООН + СО₂+ АТФ=НООС - СН₂ – СО - СООН + АДФ + Ф.

При сталому циклі щавлево-оцтова кислота утвориться з яблучної (малату).

Властиво ЦТК починається з конденсації ацетіл-КоА з молекулою щавлево-оцтової кислоти (оксалоацетату), каталізується ферментом цитратсинтазой. Продуктами реакції є лимонна кислота (цитрат) і вільний кофермент А.

За один оборот молекули пировиноградной кислоти приєднується 3 молекули Н₂О, виділяється 5 молекул Н₂ і утвориться 3 молекули О₂:

СН₃ - СО- СООН + 3Н₂О = 3О₂ +10Н⁺.

У ЦТК «спалюються» не тільки вуглеводи, але й жирні кислоти (після попередньої деградації до ацетіл-КоА), а також багато амінокислот (після видалення аміногрупи в реакціях дезамінування або переамінування).

У результаті аеробного й анаеробного розпаду вуглеводів дріжджам доставляється енергія, яка забезпечує процеси синтезу біомаси різними попередниками. Із щавлево-оцтової і α-кетоглутарової кислот у результаті відбудовного амінування і переамінування утворяться відповідно аспарагінова і глютамінова кислоти. Аспарагінова кислота може утворюватися також з фумарової кислоти. Синтез цих двох амінокислот - головне в синтезі білків з вуглеводів. При конденсації фосфодіоксіацетону з альдегідами можуть утворюватися пентози, гексози й різні полісахариди. Для синтезу біомаси дріжджі використовують і анаплеротичні шляхи, наприклад, пентозофосфатний шлях. Пентозофосфати - попередники нуклеотиїдів і нуклеїнових кислот.

Тому що при повнім окислюванні цукру енергії звільняється значно більше і утвориться достатня кількість реакцій метаболітів для синтетичних процесів, то зростає швидкість розмноження й збільшується біомаса дріжджів.

Розклад петоз.

Деградація молекул ксилози здійснюється за допомогою ксилози-5-фосфату. Схема біологічної трансформації кислоти наведено на рисунку 2.4.

Рисунок 2.4 – Розклад ксилози.

Ізомеризація пентоз веде до ксилоза-5-фосфату, розрив молекули якої дає ацетил - фосфат і глицеринальдегід-3- фосфат. Останній знову піддається гліколізу, що утворилася ж піровиноградна кислота відновлюється в молочну кислоту. Інший механізм забезпечує перехід глицеринальдегида-3-фосфату в гліцерин, оскільки відновлення можливо завдяки НАДH₂. Зі свого боку ацетилфосфат відновлюється в етиловий спирт. Це відновлення необхідно для забезпечення вторинного окислення НАД₂ у форму НАД.

Розкладання пентоз відбувається завжди з утворенням оцтової кислоти, яка утворюється з ацетальдегіду під дією ацетаткінази.