3.1.3 Определение витаминов в биологически-активных веществах и фармацевтических препаратах методом тонкослойной хроматографии

Для анализа использовали драже «Ревит». Этот комплексный препарат содержит 4 витамина (витамины А, В₁, В₂ и С) и вспомогательные вещества. Две таблетки препарата истирали в ступке до порошкообразного состояния. Добавляли 2 мл смеси тетрахлорметан – эфир (4:1), затем 2 мл воды. Экстракцию проводили при энергичном встряхивании раствора. При этом жирорастворимый витамин (витамин А) экстрагировался в органическую фазу.

Элюирующие системы: готовили путем смешивания растворов в указанном соотношении непосредственно перед использованием. Задействовали 2 системы: н-бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:1) и (60:15:25), а также систему вода – этанол (20:120). Время насыщения хроматографической камеры парами элюента- 20 мин.

Для определения витамина В₁ хроматографическую пластинку опрыскивали следующим раствором: 1,5 мл 1% водного раствора гексацианоферрата (III) калия, 20 мл дистиллированной воды, 10 мл 15% раствора NaOH. Высушенные пластинки помещали в хроматографический облучатель УФС-254-365 и просматривали в длинноволновом УФ свете (365 нм). Наблюдали ярко-голубую флюоресценцию. Детектирование витамина В₂ и витамина А проводили по собственной флуоресценции в УФ-свете (ярко-желтое пятно при 365нм). Обнаружение витамина С проводили, инкубируя пластинку в камере с I₂. В качестве стандартов для определения витаминов использовали: аскорбиновую кислоту, раствор препарата «Аевит» и тиамин-хлорид для инъекций[2].

Рисунок 19: Хроматограмма драже «Ревит» в системе бутанол – ледяная уксусная кислота – вода (4:1:1), детекция в УФ-свете (λ=365 нм): 1 – раствор витамина С (стандарт);2 – водная фаза, 5мкл; 3 – водная фаза,10 мкл; 4 – органическая фаза; 5 – «Ревит» (стандарт)

3.1.4 Индентификация отдельных витаминов

В настоящее время, согласно методикам, приведенным в Государственной фармакопеи республики Беларусь, каждый витамин определяется отдельно [1].

♦ Для идентификации фолиевой кислоты используют тонкослойную хроматографию.

Готовят:

• испытуемый раствор: 50 мг испытуемого образца растворяют в смеси из раствора аммиака концентрированного и метанола (2:9) и доводят до объема 100,0 мл этой же смесью растворителей;

• раствор сравнения: 50 мг фолиевой кислоты растворяют в смеси из раствора аммиака концентрированного и метанола (2:9) и доводят до объема 100,0 мл этой же смесью растворителей.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GP.

Подвижная фаза: раствор аммиака концентрированного – пропанол – 96% спирт (20:20:60).

Наносимый объем пробы: 2 мкл.

Фронт подвижной фазы: не менее ¾ высоты пластинки.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны 365 нм.

Результаты: на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается пятно, соответствующее по расположению, флуоресценции и размеру основному пятну на хроматограмме раствора сравнения [6].

♦ Для идентификации цианкобаламина также используют тонкослойную хроматографию. Испытания проводят с защитой от света.

Готовят:

• испытуемый раствор: 2 мг испытуемого образца растворяют в 1 мл смеси 96% спирт – вода (1:1);

• раствор сравнения: 2 мг цианкоболамина растворяют в 1 мл смеси 96% спирт – вода (1:1).

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля GP.

Подвижная фаза: раствор аммиака разведенный – метанол – метиленхлорид (9:30:4%) (камеру не насыщают парами подвижной фазы).

Наносимый объем пробы: 10 мкл.

Фронт подвижной фазы: не менее 12 см от линии старта.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку просматривают при дневном свете.

Результаты: на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается основное пятно, соответствующее по расположению, цвету и размеру основному пятну на хроматограмме раствора сравнения [6].

♦ Для идентификации витамина Е (α-токоферола) используют тонкослойную хроматографию. Испытания проводят с защитой от света.

Готовят:

• испытуемый раствор: 10 мг испытуемого образца растворяют в 2 мл циклогексана;

• раствор сравнения: 10 мг ФСО α-токоферола растворяют в 2 мл циклогексана.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля F₂₅₄.

Подвижная фаза: эфир-циклогексан (20:80, об/об).

Наносимый объем пробы: 10 мкл.

Фронт подвижной фазы: не менее ⅔ высоты пластинки.

Высушивание: на воздухе.

Проявление: пластинку просматривают в УФ-свете при длине волны 254 нм.

Результаты: на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается основное пятно, соответствующее по расположению, флуоресценции и размеру основному пятну на хроматограмме раствора сравнения [6].