2. Практична частина

Завдання практичної частини:

1. Приготування необхідних розчинів і буферів ( згідно із протоколом методу):

1. Приготування розчину для заливання гелю, що концентрує

2. Приготування розчину для заливання поділяючого гелю

3. Приготування розчину персульфату амонію

d) Дегазація розчинів для заливання, що концентрує й поділяючого гелю

2. Полімеризація поліакриламідних гелів:

1. Зібрати систему для заливання гелів, відзначити маркером границі заливання поділяючого гелю

2. Додати персульфат у розчин і залити поділяючий гель (проводити дуже швидко)

3. Обережно нашарувати приблизно 100 мкл води на гель для усунення пухирців

d) Дочекатися поки гель застигне й з'явиться чітка границя між водою й гелем - вилучити нашаровану раніше воду

е) У розчин для гелю, що концентрує, додаємо персульфат та заливаємо його у трубку на поділяючий гель

7. Обережно нашарувати приблизно 100 мкл води на гель для усунення пухирців

8. Дочекатися поки гель застигне й з'явиться чітка границя між водою й гелем - вилучити нашаровану раніше воду

2. Підготовка зразків

1. Готовимо зразки для електрофорезу: змішуємо аналізовані проби з буфером для зразків у співвідношенні 1:2 і кип'ятимо 5 хв.

2. У нижню частину камери заливаємо анодний буфер

2. Нанесення зразків та складання апарату для проведення електрофорезу:

1. Збираємо систему для проведення електрофорезу (у верхню камеру вставляємо трубочки з гелем та обережно наносимо проби (по 10 мкл у кожну), заповнюємо трубочки до верху катодним буфером (через різницю в щільності буфер зі зразками не змішується з катодним буфером),

2. Якщо трубочок зі зразками менше ніж 10 шт, то вільні отвори закриваємо заглушками.

3. Заливаємо катодний буфер у верхню частину камери

5. Проведення електрофорезу

1. Повністю збираємо систему для проведення електрофорезу й підключаємо її до джерела току: спочатку форез ведеться при силі току 2 мА на кожну трубочку (тобто 20 мА на 10 трубочок), після переходу лідируючого барвника з концентруючого в поділяючий гель силу току збільшують до 40 мА (у випадку використання стабілізації по напрузі 50 В и 120 В, відповідно)

2. Виключаємо систему, після того як смуга лідируючого барвника дійде до нижньої межі гелю

6. Фіксація й фарбування гелю

1. Гель за допомогою шприцу з водою виймаємо з трубочок і поміщаємо у фіксуючий розчин

2. Потім гель обезбарвлюємо й відмиваємо від надлишкової фарби згідно із протоколом методу

7. Аналіз результатів

1. Фотографуємо гель, використовуючи систему гель-документування

2. Аналізуємо отримані результати, використовуючи спеціальні програми

2.1Стокові розчини

Зауваження:

Для всіх розчинів необхідно використовувати або дистильовану воду.

Усі розчини готовити тільки на Трис (а не ирис-Нс1); рН доводити концентрованою соляною кислотою (не доводити рН NaОН у жодному разі!!! - це приводить до збільшення іонної сили буферу, тому, що утворюється NaCl, який сильно впливає на силу току при е/ф). Стоки, що містять акриламід і бісакриламід необхідно розчиняти при постійному перемішуванні, після доведення об’єму обов'язково профільтрувати (розчинити наважку акриламіду у 50 % об’єму, на отриманому розчині готувати розчин бісакриламіду) . Зберігати при +4°С не більш 3-х місяців.