Лактозний оперон e. Coli (індукція через зняття репресії лактозою)
Загальні положення
Структура лактозного оперону E. coli
Білок-репресор та механізм його дії
„Безпричинна” індукція
Катаболітна репресія
Захист ДНК
1. Загальні положення
Кільцева хромосома E. coliмістить 4*106 пар нуклеотидів. Цього достатньо для кодування біля 2500 різних білків. Регуляція генетичної активності у прокаріотів практично повністю здійснюється на рівні транскрипції.
Оперон– група генів, експресія яких контролюється одним оператором.
Регулон– набір оперонів (генів), які контролюються одним і тим самим регуляторним білком (репресором чи активатором).
До складу лактозного оперону входять гени, відповідальні за використання дисахариду лактози бактеріями. Цей процес здійснюється ферментами лактазою (β-галактозидазою), галактозидпермеазою (здійснює транспорт лактози через мембрани) та тіогалактозидацетилтрансферазою.
Диауксичний ріст – ріст на двох джерелах енергії, одному з яких мікроорганізм надає перевагу, наприклад, у E. coli глюкоза-лактоза.
У даному випадку глюкоза є катаболітним репресором, бо пригнічує експресію генів, відповідальних за метаболізм лактози.
2. Структура лактозного оперону E. coli
Ацетилювання β-галактозидів, які не метаболізуються, може бути пов’язане з їх детоксикацією.
Мутації lacZ і lacY призводять до нездатності використовувати лактозу як джерело енергії. Мутації lacAне викликають явних порушень росту чи поділу клітин. Без індуктора синтез іРНК з генів lacZ, Y і A відбувається повільно, бо продукт гену lacI – тетрaмерний білок – зв’язаний з оператором lacO і перешкоджає зв’язуванню з промотором lacP РНК-синтетази (виконує роль репресора).
Рис. 7.1. Структура лактозного оперону E. сoli.
lacZ,Yі A експресуються координовано. РНК-синтетаза зв’язується з промотором, але, якщо оператор зайнятий репресором, то внаслідок часткового перекривання ділянок оператора і промотора синтез РНК практично не відбувається.
3. Білок-репресор та механізм його дії
У випадку lac-оперону ген, який кодує білок-репресорlacI, знаходиться близько до кластера структурних генів lacZYA. Але це не завжди так. Транскрипція lacIне регулюється. Вона здійснюється з власного промотора з відносно низькою швидкістю і практично не залежить від статусу клітини. Тому спорідненість промотора до РНК-полімерази вважається єдиним регуляторним фактором. Синтезований мономер репресора з 360 амінокислотних залишків утворює тетраметри. Одночасно в одній клітині знаходиться більше 10 тетрaмерів. Репресор має високу спорідненість до специфічної ділянки ДНК, яка лежить між lacP і початком lacZ – це оператор lacO. Оскільки оператор частково перекривається з промотором, то репресор, зв’язуючись з оператором, фізично перешкоджає зв’язуванню РНК-полімерази з промотором і блокує ініціацію транскрипції.
Репресор має також велику спорідненість до молекули індуктора лактози. Зв’язування індуктора з репресором викликає алостеричні зміни в молекулі репресора, що істотно знижує спорідненість (в ~1000 разів) репресора до послідовності ділянки оператора ДНК. В результаті репресор дисоціює від оператора і РНК-полімераза може зв’язатись з промотором та почати транскрипцію.
Рис. 7.2. Робота лактозного оперону E. сoli.
4. „Безпричинна” індукція
Деякі невеликі молекули слугують індукторами, але самі не метаболізуються β-галактозидазою. Так, однією з таких речовин є ізопропілтіогалактозид (ІПТГ) – один з кількох тіогалактозидів, які зв’язуються з лактозним білком-репресором. Ці речовини зв’язуються з індукторною ділянкою білка-репресора і викликають відповідні конформаційні зміни, але самі не розщеплюються β-галактозидазою. Такий тип індукцій називається безпричинною. В клітині він забезпечує постійну низьку ступінь експресії і речовини, що його забезпечують, не метаболізуються ефекторною групою генів. Це забезпечує синтез певної кількості білків – продуктів lacZYA-кластеру. Через це в клітині завжди присутня певна кількість молекул пермеази. Ймовірно, саме це забезпечує надходження в клітину перших молекул лактози, що викликають індукцію оперону при появі у середовищі лактози.
5. Катаболітна репресія
Аналогічно дії глюкози як катаболітного репресора в парі з лактозою, катаболічна репресія знайдена в арабінозному та галактозному оперонах. Катаболітна репресія починається, коли в клітині знижується вміст цАМФ. Вважається, що глюкоза впливає на синтез або деградацію цАМФ. Остання зв’язується з САР-білком (Catabolite Activator Protein) або CRP ( cAMP receptor protein).
САP – алостеричний регуляторний білок, який зв’язується з САP-ділянкою промотора lac-оперону. Взаємодія САP-білка з цАМФ сильно збільшує спорідненість білка до відповідної ділянки ДНК. Зв’язування САP-білка прискорює зв’язування РНК-полімерази з промотором. Тобто комплекс САP-цАМФ здійснює позитивний контроль транскрипції оперону. Якщо САP-ділянка не зайнята, РНК-полімераза гірше зв’язується з промотором і транскрипція оперону відбувається менш ефективно. Тому, оскільки в присутності глюкози рівень цАМФ знижується, РНК-полімераза повільно транскрибує lac-оперон. І, навпаки, коли мало глюкози, рівень цАМФ зростає, комплекс САP-цАМФ зв’язується з САР-ділянкою. Це, в свою чергу, викликає збільшення транскрипції.
6. Захист ДНК
Звернемось знову до контрольних елементів lac-оперону.
Рис. 7.3. Контрольні елементи лактозного оперону.
Для визначення ділянки, з якою зв’язується РНК-полімераза, lac-промотор клонували в бактеріальну ДНК або плазміду. Очищену РНК-полімеразу додавали до вказаної ДНК і після цього обробляли ДНКазою I. Сегмент ДНК, який не деградував під дією нуклеази, виділяли і визначали його нуклеотидну послідовність. Кінці сегменту, який захищається від деградації можуть дещо варіювати, але вказують на місце взаємодії РНК-полімерази з молекулою ДНК. Саме цей спосіб і був використаний для ідентифікації специфічної ділянки зв’язування РНК-полімерази у регуляторній ділянці lac-оперону.
Лекція 8