(E. coli F-, Pro+, Ura+, His+, Strr).
2 Мл культури реципієнта (f-)
Культура донора (F+)
Внести в 2 мл культури реципієнта 1 мл культури донора
Рисунок 59 – Схема постановки досліду кон’югації
Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.
Дослід трансформації.Трансформація – безпосередня передача генетичного матеріалу (фрагменту ДНК) донора реципієнтній клітині.
Для проведення досліду трансформації стійкості до стрептоміцину взяли:
культуру реципієнта – золотистий стафілокок чутливий до стрептоміцину;
ДНК, яка виділена з культури донора стафілокока стійкий до стрептоміцину;
селективне середовище – МПА зі стрептоміцином.
Методика проведення досліду.
У стерильну пробірку налили 1 мл бульйонної культури реципієнта та 1 мл розчину ДНК донора (1мкг). Суміш поставили в термостат на 40 хвилин при температурі 37 ºС. Потім посіяли петлею на селективне середовище вміст із дослідної пробірки (після трансформації) та для контролю з пробірки з культурою реципієнта. ДНК донора, проникаючи в клітини реципієнта, інтегрується в хромосому і передає ген стійкості до стрептоміцину, рекомбінантам, які дають ріст колоній на МПА зі стрептоміцином. Якщо ж ДНК донора перед додаванням до культури реципієнта обробити дезоксирибонуклеазою, то трансформуючий фактор не передає спадкових властивостей донора. Трансформуються, як правило, окремі властивості, але іноді одночасно декілька ознакузчепленому стані.
1 Мл бульйонної культури реципієнта
1 мл розчину ДНК донора
Інкубація у термостаті 37 oС – 40 хвилин
Контроль
Дослід
Ріст колоній рекомбінантів
Рисунок 60 – Схема постановки досліду трансформації
Результат досліду занесіть до протоколу, зробіть висновок.
Зверніть увагу, що в дослідах кон’югації та трансформації контрольні посіви на селективних середовищах стерильні. На середовищах із антибіотиками спостерігається ріст колоній рекомбінантів. У досліді трансдукції в контрольному посіві видно ріст безбарвних колонійE. coli lac-, а після досліду трансдукції на чашці серед безбарвних колоній є і колонії червоного кольору – це рекомбінантиE. coli lac+.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)
У сучасній лабораторній діагностиці ПЛР займає особливе місце. Метод ПЛР підняв клінічну лабораторну діагностику на принципово іншу висоту – рівень визначення нуклеїнових кислот (ДНК та РНК), що дозволяє провести пряме визначення інфекційного агента або генетичної мутації в будь-якому біотичному або абіотичному середовищі. При цьому способом ПЛР можна виявити (навіть) тільки одну молекулу НК серед мільйонів інших молекул.
Принцип методу ПЛР.
В основу методу ПЛР покладено
унікальну властивість НК (як РНК, так і
ДНК) – здатність до самореплікації, яка
відтворюється штучно in
vitro. При
цьому синтезуються суворо специфічні
фрагменти НК. У зв’язку з цим перед тим,
як проводити ПЛР, необхідно визначити
нуклеотидну послідовність НК, яку
досліджуємо. Після цього синтезуються
два коротких однониткові ДНК-зонди або
праймери, які комплементарні певним
ділянкам НК-мішені. Праймер – найголовніший
елемент у ПЛР, який забезпечує запуск
і специфічність реакції. Таким чином,
тест-система ПЛР, складається з суміші
НК зразка, що досліджується, праймера,
дезоксирибонуклеотидів (набору
нуклеозидмонофосфатів) і термофільної
ДНК-полімерази (ензиму термофільних
бактерій Termus
aquaticus).
Вищезазначену реакційну суміш піддають
повторним циклам нагріванням/охолодження
для денатурації (при нагріванні до
92–98ºС) НК і гібридизації або віджигу
(при охолодженні) праймерів з метою
синтезу (за допомогою ДНК-полімерази)
нових НК.
Рисунок 61 –Термоциклер
Хід ПЛР можна подати як три основних етапи власне ампліфікації: денатурації, віджигу та синтезу (подовження) НК. Сама ПЛР проходить автоматично в програмованому термостаті - термоциклері (ампліфікаторі), який може нагрівати та охолоджувати пробірки з реакційною сумішшю в дуже короткий час. Триступеневий цикл, у результаті якого отримуються точні копії ділянки матричної НК, що визначається, повторюються 30 – 50 разів згідно з заданою програмою термоциклеру.
У першому циклі відбувається перше подвоєння фрагмента НК, обмеженого праймерами, далі реакція набуває каскадного характеру (ланцюгова реакція). Це означає, що кожна з ниток служить матрицею для синтезу (полімеризації) нової ділянки НК, що дозволяє збільшити кількість копій фрагмента НК у геометричній прогресії. Перебіг ПЛР аналогічний природній реплікації НК, але при цьому суворо фіксовано штучно синтезованим праймером.
Продукти ПЛР, або амплікони, що являють собою ділянки синтетичної НК, що обмежена праймерами, на кінцевій стадії ПЛР виділяються методом електрофорезу в гелі.