Marri_i_dr_-_Biokhimia_cheloveka_tom_1

Рис. 8.7. Схематическое представление конформационных изменений в молекуле фермента при связывании субстрата согласно модели индуцированного соответствия. Обратите

внимание на расположение ключевых остатков до и после

связывания субстрата (по Кошланду).

же индуцированного соответствия субстрат индуци­

рует конформационные изменения фермента, и лишь в результате этих изменений аминокислотные остат­ ки и другие группы фермента принимают простран­ ственную ориентацию, необходимую для связыва­ ния субстрата и катализа. При этом другие аминоки­ слотные остатки могут погрузиться в глубь молеку­ лы фермента.

В примере, приведенном на рис. 8.7, в связывании субстрата принимают участие гидрофобные и заря­ женные группы (области, выделенные точками). Не­ посредственно в катализе участвуют остаток фосфо­ серина (Р) и - SН-группа цистеина. Другие остатки,

не вовлеченные ни в тот, ни в другой процесс, пред­

ставлены остатками Lys и Met. В отсутствие суб­ страта каталитические и субстратсвязывающие

группы находятся друг от друга на расстоянии, в не­

сколько раз превышающем длину связи. Субстрат по мере сближения с ферментом индуцирует в по­

следнем конформационные изменения, в результате

которых соответствующие группы занимают поло­

жение, необходимое для связывания субстрата и для

катализа. Одновременно меняется пространственное

расположение других octatkob-Lуs и Met теперь оказываются сближенными (рис. 8.7).

Аналоги субстрата тоже могут вызывать конфор­

мационные изменения, но не все из них являются

«правильными» (рис. При связывании истинно­ го субстрата (А) все группы (черные кружочки) зани­ мают нужное положение. При связывании же анало­

га субстрата- более объемного (рис. 8.8,Ь) или, наоборот. меньшего по размеру (рис. 8.8,В)-

Рис. 8.8. Схематическое представление конформационных

изменений в ферменте при связывании истинного суБСl рата

(А) и его аналогов (Б, В).

Белок

Белок

~ ::e:::--:rtD

г~

~

Рис. 8.9. Схема альтернативных путей реакции при ИНДуци­ ровании субстратом конформационных изменений в фер­ менте. Фермент сначала претерпевает конформационное

изменение (А), затем связывает субстрат (Б). На альтерна­ тивном пути фермент сначала связывает субстрат (В), а за­

тем претерпевает конформационное изменение (Д). Нако­

нец оба процесса могут развиваться согласованным обра-

~OM (1) с образованием конечной конформации (F.).

индуцируется неправильное расположение этих

групп. Еще одной структурной особенностью фер­

мента является небольшая выемка в правой части.

Представим, что в эту выемку попадает регулятор­

ная молекула, «удерживающая» один из полипеп­

тидных участков, который несет каталитическую

группу, от перемещения. Тогда будет происходить

лишь связывание субстрата, но не катализ. Остается выяснить ТQЧНУЮ последовательность

событий, из которых складываются индуцирован­ ные субстратом конформационные изменения. Здесь возможно несколько путей. представленных на рис.

8.9.

Предположим, что нам известна полная первич­

ная структура фермента. Даже в этом случае обычно

бывает трудно решить, из каких именно остатков

формируется каталитический центр. Как явствует из

модели индуцированного соответствия, эти остатки

могут располагаться далеко один от другого в пер­

вичной структуре, но быть сближены в трехмерной

(третичной) структуре.

В формировании каталитического центра прини­

мают участие аминокислотные остатки нескольких

сегментов полипептидной цепи, как в случае гемо­ глобина (гл. 6) или химотрипсина (гл. 9).

Каталитический центр лизоцима

Лизоцим присутствует в составе слез, носовой

слизи, слюны, желудочного секрета, в различных

тканях, а также в молоке и яичном белке. Этот фер­

мент катализирует гидролиз ~-l ,4-связей N-

ацетилнейраминовой кислоты (см. гл. 13 и 33), вхо­ дящей в состав протеогликанов и глюкозаминогли­

канов. Лизоцим, присутствующий в слезах и носовой

дающих из воздуха грамположительных бактерий.

Лизоцим (мол. масса около 15000) образован одной

полипептидной цепью, содержащей 129 остатков.

Поскольку в составе молекулы нет ни кофермента,

ни ионов металлов, катализ, специфичность и трех­

мерная структура лизоцима целиком определяются

в KOTOPYJO выступаJOТ два остатка, His 12 и His 119. Из полученных ранее химических данных следовало,

что эти остатки входят в состав каталитического

центра. Оба они располагаJOТСЯ вблизи места связы­

вания уридиловой кислоты (рис. 8.11).

аминокислотной последовательностью. В молекуле

имеются небольшие области складчатого слоя, не­

сколько коротких а-спиралей и достаточно большие

участки с нерегулярной структурой. Цветной снимок

трехмерной модели лизоцима в комплексе с субстра­ гом можно найти в работе J. Biol. Chem. 1968: 243, 1663. Посредине молекулы лизоцима проходит глу­

бокая щель, в которой находятся остатки, форми­

рующие каталитический центр и субстратсвязываю­ щую область~ последняя содержит шесть участков,

взаимодействующих с разными субстратами или ин­

гибиторами (рис. 8.10). Остатки, ответственные за

расщепление связи, располагаются между участками

D и Е; наиболее важную роль играют карбоксильные

группы остатков Asp 52 и Glu 35. Последний, по всей вероятности, протонирует ГЛИКОЗИДНУJO связь суб­ стр.па, а отрицательно заряженный остаток Asp 52. располагающийсst на противоположной стороне, стабилизирует образующийся в результате карбо­

ниевый ион.

Каталитический центр рибонуклеазы

Вотличие от ситуации с лизоцимом информация

окаталитическом центре рибонуклеазы была в зна­

чительной мере получена еще до определения ее

трехмерной структуры. Выводы. основанные на хи­

мических исследованиях, подтверждены кристалло­

Аминокислотные последовательности

в области каталитического центра

Первичная структура в окрестности каталитиче­

ского центра у различных семейств гидролитических

ферментов оказывается довольно близкой (табл.

8.1). Это позволяет предполагать, что механизмы

гидролиза связей в биологических системах относи­ тельно немногочисленны. Поэтому неудивительно. что аминокислотные последовательности в оБЛdСТИ каталитического центра у одного и того же фермен­

та, выделенного из разных видов, еще более сходны.

ФАКТОРЫ, ВЛИЯЮЩИЕ НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ

Ферментативная активность зависит в основном

от следуJOЩИХ факторов: концентрация фермента и субстрата, температура, рН, присутствие ингиби­

торов.

ТЕМПЕРАТУРА

в некотором ограниченном интервале темпера­ тур скорость ферментативной реакции повышается

щий. во сколько раз повышаетс~ скорость реакции

при повышении температуры на 100. называется тем­

пературным коэффициентом и обозначается Q.o. Для

многих биологических реакций при повышении тем­

пературы на 100 скорость удваивается (QIO = 2) и,

аналогично. при понижении температуры на 10-

уменьшается вдвое. Многие физиологические про­

цессы (например. скорость сокращения изолирован­

ной сердечной мышцы) тоже характеризуются

коэффициентом QIO'близким к двум.

Типичная зависимость скорости ферментативной реакции от температуры представлена на рис. 8.12.

Видно. что при некой оптимальной температуре ско­ рость реакции максимальна. Повышение скорости

реакции по мере приближения к оптимальной темпе­

ратуре слева объясняется увеличением кинетической энергии реагирующих молекул. При дальнейшем по­

вышении температуры кинетическая энергия моле­

кулы фермента становится достаточной для разрыва связей, поддерживающих вторичную структуру фер­

~eHTa в нативном, каталитически активном состоя­

нии (происходит тепловая денатурация фермента). Вторичная и третичная структура фермента разру­ шается. что сопровождается потерей каталитической

активности.

Для большинства ферментов оптимальная тем­

пература равна или выше той температуры, при ко­

торой в норме находятся клетки. Для ферментов ми­ кроорганизмов, адаптировавшихся к обитанию

в природных горячих источниках. оптимальная тем­

пература может быть близка к точке кипения воды.

рН

Умеренные изменения рН оказывают влияние на ионное состояние фермента, а зачастую и субстрата. Как показывают измерения ферментативной актив­

ности при различных рН, оптимум активности нахо­

дится обычно между рН 5,0 и 9,0. Вместе с тем отде­

льные ферменты. например пепсин. активны при зна­ чениях рН. лежащих далеко за пределами этого ин­

тервала.

Зависимость активности от рН определяется сле­

дующими факторами.

1. Денатурацией фермента при очень высоких или

очень низких рН.

2. Изменением величины заряда молекул субстра­

та или фермента. Активность фермента может изме­ няться в результате изменений либо его структуры,

либо заряда функциональных остатков, участвую­

щих в катализе или СВЯЗ~lВании субстрата. Рассмо­

трим для примера взаимодействие отрицательно за­

ряженного фермента (Enz-) с положительно заря­ женным субстратом (SH +):

Enz- + SH+ - Enz - SH.

При низких рН происходит протонирование Enz-:

Enz- + Н+ - EnzH.

а при высоких рН - депротонирование субстрата:

SH+ -S + Н+.

Поскольку взаимодействовать друг с другом мо­

гут только SH + и Enz-, при крайних значениях рН

эффективная концентрация Enz- или SH+ будет низ­

кой, что приведет к снижению скорости реакции

(рис. 8.13). И только в области, выделенной двойной

штриховкой. в нужном ионном состоянии находятся одновременно и Enz, и S, а максимальной концен"" трации они достигают в точке х.

ОПТИМ8ЛltН8А температура

Рис. 8.12. Влияние тс'\шературы на скорость гипотетиче­ ской ферментативной реакции.

х~Enz-

Низкий рН Высокий

•

Для реакции

А + 2B-AB~

выражение для скорости реакции имеет вид

Скорость реакции ос [А][В][В],

или

Скорость реакции ос [А][В]2.

В общем случае, когда n молекул А реагируют с

т молекулами В,

пА + тВ - АnВт,

выражение для скорости реакиии принимает вид

PIIC. 8.13. Влияние pll на активность ф~рмента.

При изменении рН ферменты могут претерпевать

конформационные изменения. Для поддержания ак­

тивной третичной или четвертичной структуры мо­

жет оказаться необходимым присутствие определен­

ного заряда на группе, удаленной от области связы­ вания субстрата; именно такая ситуация наблюдае­

тся в случае гемоглобина (гл. 6). Если заряд этой

Скорость реакции ос [А],,[в]т.

КОНСТАНТА РАВНОВЕСИЯ

Поскольку все химические реаКlIИИ обратимы, для обратной реакиии (по отношению к той, когда n молекул А реагируют с т молекулами В)

АnВ," - пА + тВ

соответствующее выражение для скорости реакции

группы изменится, могут произойти частичное раз­

вертывание белковой цепи, или, наоборот, компак­

тизаllИЯ молекулы, или же ее диссоциация на прото­

меры - во всех случаях с потерей активности.

КОНЦЕНТРАЦИЯ РЕАКТАНТОВ

При увеличении концентрации реактантов возра­

стают число молекул, обладающих достаточной для реакции энергией, и частота их столкновений. Рас­

смотрим реакцию между двумя разными молекула­

ми А и В:

А + В-АВ.

удвоение концентрации А или В приведет к увеличе­

нию вдвое скорости реакции, а удвоение концентра­

ций одновременно А и В повысит вероятность их столкновений в четыре раза. Следовательно, скоро­

сть реакции возрастет вчетверо. Скорость реакции

пропорциональна концентрациям реагирующих моле­

кул. Квадратные скобки используются для указания

молярных ·концентрациЙ 1. символ ос означает про­

порциональность. Выражение для скорости прини­

мает вид

Скорость реакции ос [Реагирующие молекулы],

или

Скорость реакции ос [А][В].

I CTporo говоря, должны использоваться не молярные

будет иметь вид

Скорость реакции ос [А.,Вт].

Обратимость обозначается двойными стрелками:

пА + тВ ~ АnВт.

Это выражение следует читать: n молекул А и т мо­

лекул В находятся в р<tвновесии с А"В",. Знак про­

порциональности ос можно заменить на знак равен­

ства, если ввести коэффициент пропорциональнос ги k, характерный для рассматриваемой реакции. В обшем случае

пА + тВ ~AnBт

выражения для скорости прямой реакции (Скоро­

CTb 1) и обратной реакиии (Скорость 1) принпмают

вид

СКОРОСГЬ1 = k,[A]"[B]"'.

Скорость 1 = k ,[АnВn,].

Когда скорости прямой и обратной реакции равны,

говорят, что система находится в равновесии:

СКОРОСТЬ1 = Скорость _l'

k,[A]"[B]m = k 1[А"В,"].

Отсюда

Отношение k, к k _1 называется константой равнове­ сия Keq • Следует запомнить с~,едующие свойства си-

акций (но не их констннты) рнвны.

з. Равновесие является динамическим состоянием. Хотя суммарного изменения концентрации ренгентов

ипродуктов в рнвновесии не происходит. А и В по­

сгоянно превращаются в А"Вm• и наоборот.

4.Е('ли известны равновесные концентрации А, В

иА"Вm• можно найти численное значение константы

равновесия.

Связь между константой равновесия и изменением стандартной свободной энергии

(~GO) реакции

Константа равновесия связана с fiG соотноше­

нием

~G~ = - RT ln К~ч'

Здесь R - газовая постоянная. Т-абсолютная тем­ пературн. Поскольку их зннчения известны. зная

численное значение Ксч• можно найти A-G . Если кон­ станта равновесия больше единицы, реакция идет са­

мопроизвольно. т. е. в том направлении. как онн на­

писнна (слева направо). Если же константа равнове­

сия меньше единицы. то самопроизвольно идет

обратная реакция. Заметим. однако. чго константа

рнвновесия указывает направление. в котором реак­

ция может идти снмопроизвольно. но не позволяет

судить, будет ли реакция идти быстро. Иными слова­

ми. она ничего не говорит о высоте энергетического

барьера реакции (6G..-; см. выше). Это следует из то­

го, что Ксч определяет только 6GO. Скорости реакций зависят от высоты энеРI-етического барьера, но не от веJlИЧИНЫ A-G".

- Большинство факторов, влияющих на скорости

ферментативных реакций. оказывают свое действие

путем Иlменения локальных концентраций реаген­

тов.

КОНЦЕНТРАЦИЯ ФЕРМЕНТА

Во многих случаях бывает недостаточно знать, что данный фермент присутствует в системе. нужна еще информация о его количестве. При определен­ ных условиях скорость ферментативной реакции пря­ мо пропорциональна количеству фермента (гл. 7).

Это бывает не всегда, что можно проиллюстри­

ровать на примере прямой реакции, идущей в равно­

весных условиях. Даже если мы знаем, что прямая реакция действительно идет. нам будет казаться, что

скорость ее равнн нулю, поскольку с такой же скоро­

стью идет и обратная реакция. Когда же фермента­

тивная реакция только начинается, продукт еще

практически отсутствует и обратная реакция не идет.

начальная скорость (1:). будет IIРЯМО Ilропорциональна

концентрации фермента IEnzl (гл. 7).

ФеРl\Jент jJвляется реактннтом, который соеди­ няется с субстратом, образуя фермеит-субстратиый комплекс Enz - S, rаспадающийся на свободный фермент и продукт Р. В простейшей форме можно

Отметим. что хотя в выражения для скоростей прямой и обратной реакций входит член [Enz]:

CKOPOCTb1 = k,[Enz][S]. Скорость _1 = k _,[Enz][P],

в выражении для константы равновесия [Enz] уже не

Таким образом, концентрация фермента не оказывает

влияния на константу равновесия. Ксч не зависит от то­

го, каким образом достигается равновесие- с уча­ стием фермента или без него (вспомним о величине 6GO). Фермент меняет путь. по которому идет реак­

ция, но не конечные (равновесные) концентрации ре­

агентов и продуктов, от которых зависят Kcq и 6G

КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБСТРАТА

Далее мы будем рнссматривать ферментативные реакции. в которых имеется единственный субстрат

и единственный продукт. Такая ситунция действи­

тельно наблюдается для некоторых ферментатив­

ных реакций, однако большинство из них протекает

с участием двух и более субстратов и продуктов. Это. однако. нисколько не снижает ценности даль­

нейших рассуждений. То. что справедливо для одно­ го субстрата. остается верным и для двух.

При увеличении концентрации субстрата [S] и со­

хранении всех остальных условий начальная скоро­ сть v (скорость. измеряемая в период, когда израсхо­

дована очень малая доля субстрата) будет повы­ шаться до максимальной величины '/Jnи,. после чего останется постоянной (рис. 8.14).

По мере повышения конuентраuии субстрнта ско­

рость будет расти до тех пор, пока не ПРОИl0йдет на­

сыщения фермента субстратом. Измеренная в таких

условиях начальная скорость уже не будет возра­ стать при дальнейшем повышении конuеllтраuии субстрата. Отметим, что субстрат обычно берут

в значительном молярном избытке по огношению

к ферменту. Например. если фермент с мол. массой 1О000О взаимодейс гвует с субстратом с мол. массой

с

V тах --------=.;:;;11..,---

}V 02

m. /

------------}V ./2

m

[Sj

•

Рис. 8.1 .... 111ШIШIС !(UlIl/.СIIГРLlIt\ш с~бсгri.lта на "':КLJIЮСli.

Фсr~1СН г.п IIПlюii рсаКНИII.

шение [S], хотя и повысит частоту столкновений Enz

с S, не сможет привести к повышению скорости реак­

ции-среди молекул фермента уже не будет таких,

которые были бы свободны для реакции с субстра­

том.

Случай В представляет особый теоретический ин­

терес, поскольку при этом ровно ПОЛОВИНd молекул

фермента насыщена субстратом. Соответственно

скорость равна половине максимальной скорости ( Vmaxl2), достижимой при данной концентрации фер­

мента.

100 и оба присутствуют в концентрации I мг/мл, то на каждый моль фермента будет приходиться 1000 молей субстрата. Более реальными являются сле­

дующие величины:

[Enz] = 0,1 мкгjмл = 10-9 М, [S] = 0,1 мг/мл = 10-3 М,

т. е. молярный избыток субстрата по отношению к ферменту составляет 106.

Даже если [S] уменьшить в 100 раз, его концен­ трация все еще в 10 000 раз будет превышать концен­ трацию фермента.

Ситуация. соответствующая точкам А, В и С на

рис. 8.14, проиллюстрирована на рис. 8.15. В точках А и В в комплексе с субстратом находится лишь часть молекул фермента, хотя молекул субстрата на­ много больше, чем молекул фермента. Это происхо­

дит потому, что константа равновесия реакции

Enz + S р Enz - S (образование комплекса Enz - S)

хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках

А и В повышение нли поннженне IS) будет приводить

к увеличению или уменьшению доли молекул Еnz, связанных с S (т. е. доли молекул Enz - S), и v будет зависеть от IS). в точке С практически все молекулы фермента связаны с субстратом, и дальнейшее повы-

УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА-МЕНТЕН

Графическое определ~ние константы Михаэлиса КМ

Концентрация субстрата, при которой скорость со­

ставляет половину максимальной, обозначается через

КМ и называется константой Михаэлиса. Ее можно

определить из графика зависимости {" от [S] (рис.

8.14). Обратите внимание. что КМ имеет размерность

молярной концентрации.

Когда [S] приближается к Км, v становится весьма чувствительной к изменению [S]; в этой области фер­ мент работает со скоростью, равной половине мак­

симальной. Многие ферменты характеризуются та­ кими значениями Км• которые примерно соответ­ ствуют физиологическим концентрациям их субстра­

тов.

Уравнение Михаэлиса-Ментеll

Vmax[S]

V = ---..:=~-=-

КМ + [S]

·описывает поведение многих ферментов при измене­

нии концентрации субстратов. Используя это урав­

нение, зависимость начальной скорости фермента­ тивной реакции от [S] и КМ можно проиллюстриро­

вать на следующих конкретных примерах.

1.IS) много меньше КМ (точка А на рис. 8.14 и 8.15).

Вэтом случае величину [S] в знаменателе можно опу­

стить, и он будет практически равен Км. Отношение

двух констант, Vmax И Км, можно заменить новой

константой К. Таким образом, имеем:

УmаХ [S] и= КМ + [S] .

(~ означает «примерно равно»).

Другими словами, когда концентрация субстрата

значите.'1ЬНО ниже той, при которой скорость реакции

состаВJ1яет ПОJl0ВИНУ максимальиой (т. е. 'зиачительио меньше Км ), начальная скорость v пропорциональна концентрации субстрата [S].

2. ISI много больше КМ (точка С на рис. 8.14

и 8.15). В этом случае член Км в знаменателе можно

опустить, т. е.

V [S] v= max .

КМ + [S]'

Это означает, чrо при концентрации субстрата IS), намного превышающей Км, начальная скорость v рав­

на максимальной Vmax'

Это означает, что при концентрации субстрата, равной Км , начальная скорость реакции v составляет

половину максимальной. Отсюда же следует способ

оценки Км: надо экспериментально определить кон­

центрацию субстрата, при которой начальная скорость равна половине максимальной.

Для многих ферментов определение Vmax (а зна­ чит, и Км) непосредственно из графика зависимости v от [S] оказывается затруднено. Для этого исполь­ зуют уравнение, обратное уравнению Михаэлиса­ Ментен, т. е.

Итак, мы имеем -уравнение прямой

у=ах+Ь,

где у = l/v и х = l/[S).

Если построить график зависимости у (т.е. l/v) от х (т.е. 1/[S), то длина отрезка Ь, отсекаемого от оси у, будет равна I/Vmax ' а тангенс угла наклона а­ KM/Vmax ' Длину отрезка, отсекаемого от оси х (в

области отрицательных значений), можно получить, приравняв у нулю. Тогда

Ь

х=--=--.

аКМ

График уравнения Михаэлиса- Ментен в обрат­ ных координатах называют графиком Лайнуивера­ Бэрка (рис. 8.16). Используя его, Км можно найти либо из наклона прямой и длины отрезка, отсекае­ мого от оси у, либо из длины отрезка, отсекаемого в области отрицательных значений от оси х. Поско­

льку [S] имеет размерность м.олярной концентрации, Км тоже измеряется в молях на литр. Скорость v мо­

жет быть выражена в любых единицах, поскольку Км не зависит от IEnz.). График, построенный в обрат­ ных координатах, позволяет определить Км по отно­

сительно небольшому числу точек, именно поэтому

он часто используется для нахождения Км"

Используя график Лайнуивера- Бэрка на прак­

тике для оценки Км, иногда сталкиваются с тем, что

почти все точки оказываются в области низких кон­

центраций субстрата. Это происходит в том случае,

когда измерения проводят через равные интервалы

[S]. Чтобы этого избежать, измерения следует прово­

дить при таких значениях [S), которые соответ­

ствуют равным интервалам по шкале обратных ве­

личин.

Альтернативный подход к экспериментальной

оценке Км и Vmax предложили Иди и Хофсти. Уравне­

ние Михаэлиса- Ментен можно преобразовать

КМ + [S]

vУmаХ [S] ,

ипредставляют его правую часть в виде суммы двух слагаемых:

Отсюда, упростив, получаем

КМ

Наклон = ---

--.,

V max

графического определения КМ и Vтах'

для определения Vmllx' Графики, построенные

в обратных координатах, находят широкое примене­

ние при оценке действия ингибиторов.

Соотношение между КМ и Kd - константой

диссоциации фермент-субстратного комплекса

Сродство фермента к субстрату равно величине,

обрапюй константе диссоциации Kd комплекса Enz--S:

k

Enz + S ~1 Enz-S,

k_ 1

ОГРАНИЧЕНИЯ, ПРИСУЩИЕ УРАВНЕНИЮ МИХАЭЛИСА-- МЕНТЕН

Некоторые ферменты и другие лигандсвязываю­

щие белки, например гемоглобин (см. гл. 6 и 10), не

подчиняются классической кинетике насышения Ми­

хаэлиса- Ментен. График зависимости fJ от [S] но­

сит в этом случае сигмоидный характер (рис. 8.17).

Это обычно указывает на кооперативное связывание

субстрата многими центрами-связывание с одним

центром влияет на связывание с другим. как это про­

исходит с гемоглобином (гл. 6).

k_

K d =-,;:1.

Иными словами, чем слабее выражена тенденция

фермент-субстратного комплекса к диссоциации, тем выше сродство фермента к субстрату.

Мерой Kd может ориентировочно служить знач~­

ние КМ дЛЯ данного фермента по отношению к его

субстрату. Однако·это возможно только.в том слу­

чае, если справедливо допущение, использовавшееся

при выводе уравнения Михаэлиса- Ментен. Оно со­

стояло в том, что первая стадия ферментативной ре­

акции

k

Enz + S ~ Enz-S

k

-1

идет быстро и при этом всегда на этой стадии под­ держивается равновесие. Другими словами, скоро­

сть диссоциации Enz - S на Enz + S намного выше,

v

O~~_________________________ ~

PIIC. 8.11. СИl"моидная кинетическая кривая с насыщением.

в таком случае описанный выше метод графиче­

ской оценки концентрации субстрата, при которой

ск:.эрость реакIVIИ составляет половину максималь­

ной, оказывается непригодным (прямой в соответ­

ствующих коордкнатах уже не получается). Здесь следует обратиться к графическому представлению уравнения Хилла, первоначально предложенного для описания кооперативного связывания 02 с гемо­ глобином (гл. 6). Уравнение Хилла, преобразован­

ное так, чтобы график в соответствующих координа­ тах представлял собой прямую, имеет вид

где k' - константа. Из уравнения следует. что в усло­

виях, когда [S] мало по сравнению с k', скорость реак­ ции возрастает как n-я степень [S). На рис. 8.18 приве­ ден график Хилла, построенный по кинетическим

данным для фермента, характеризующегося коопе­

ративным связыванием субстрата. График зависи­ мости log (v/Vma.. - v) от log [S] представляет собой

прямую с тангенсом угла наклона, равным n, где n -

эмпирический параметр, зависящий от числа суб­

стратсвязывающих центров и характера взаимодей­

ствия между ними. При n = 1 связывающие центры не зависят друг от друга. При n > I между центрами имеется кооперативное взаимодействие; чем больше n. тем выше степень кооперативности и тем более

выражена сигмоидность кривых насыщения. При n < 1 говорят об отрицательной кооперативности.

Когда скорость реакции равна половине макси­

мальной (v = Vтах/2), v/( Vma..-v) = 1 и log [v/( Vma..-

- v») = О. Таким образом, чтобы определить величи­ ну Sso (концентрацию субстрата, при которой скоро­

сть вдвое меньше максимальной), нужно из точки на

прямой, для которой log [t,/( Vmax-V») = О, опустить

перпендикуляр на ось х.

v

log

1

1

1 Наклон =n

__ -.J1

-1

log [S)

ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ

ФЕРМЕНТОВ .

Различают два больших класса ингибиторов фер­

ментативной активности - конкурентные и неконку­ рентные-на основании того, ослабляется (конку­

рентное ингибирование) или не ослабляется (некон­

курентное ингибирование) их ингибирующее дей­ ствие при повышении концентрации субстрата. На

практике многие ингибиторы не проявляют тех

свойств, которые характерны для чисто конкурент­

ного или чисто неконкурентного ингибирования. Другой способ классификации ингибиторов основы­ вается на характере места их связывания. Одни из них связываются с ферментом в том же месте, что и субстрат (в каталитическом центре), а друг.ие-на

значи'rельном расстоянии от активного центра (в ал­ лостерическом центре).

Конкурентное ингибирование аналогами субстрата

Классическое конкуретное ингибирование осно­ вано на связывании ингибитора с субстратсвязываю­

щим (катаЩlТическим) центром. Химическая струк­ тура аналога субстрата, действующего как ингиби­

тор (1), обычно сходна со структурой субстрата (S). Поэтому ингибитор может обратимо связывнться с ферментом, образуя вместо Enz - S комплекс

Enz - 1, т. е. фермент-ингибиторный комплекс. Ког­

да в реакционной ~меси одновременно присутствуют

и субстрат, и ингибитор указанного типа, они конку­

рируют за один и тот же связывающий центр на по­

верхности фермента. Один из наиболее подробно изученных примеров конкурентного ингибирова­ ния - это ингибирование сукцинатдегидрогеназы

малонатом (1). конкурирующим за один и тот же

центр с субстратом сукцинатом (S). Сукцинатдегидрогеназа катализирует образова­

ние фумарата в результате отщепления атома водо­

рода от каждого из двух а-углеродных атомов сук­

цината (рис. 8.19). Малоннт ( 00C~H2~00 )

способен связываться с дегидрогеназой, образуя

комплекс Enz - 1. От Са-атома малоната отщепле­

ния атома водорода произойти не может. Комплекс

Enz --:- 1 может только распадаться на свободный фермент и ингибитор. Для этой обратимой реакции

Enz-I " Enz 1

~ +

"-1

константа равновесия К, равна

I Сукцинат­

Ндегидро­ геназа

Действие конкурентных ингибиторов можно представить в виде следующих реакций:

Скорость образования продукта- обычно имен­

но она является объектом измерения - зависит

только от концентрации комплекса Enz-S. Пред­ положим, что 1 очень прочно связывается с фермен­ том (К, мала). Тогда количество свободного фермен­ та (Enz), который мог бы присоединять S, образуя комплекс Enz-S, а затем и Enz + Р, будет весьма мало. Таким образом, скорость реакции (образова­ ния Р) будет мала. По аналогичным причинам при той же концентрации слабо связывающегося ингиби­

тора (К; велика) катализируемая реакция существен­ но не замедлится. Предположим теперь, что при

фиксированной концентрации ингибитора I добав­ ляется все большее количество субстрата S. Это по­ вышает вероятность образования комплекса Enz - S по сравнению с комплексом С ростом отно­ шения [Enz-S)/[Enz-I] будет расти и скорость ре­

акции. При до~таточно высокой концентрации

S концентрация комплекса Enz - 1станет исчезающе мала. Но тогда скорость катализируемой реакции будет такой же, что и в отсутствие 1 (рис. 8.20).

о1

ISТ

Рис. 8.20. График Лайнуипера - Бэрка для случая классиче­

ского конкур(.нтного ингибирования. Обратите внимание на nOIIНoe отсутствие ингибирующего действия при высо-

ких значениях [S) (низких значениях Oj[S).

Графическая оценка констант конкурентного ингибирования

"'1

На рис. 8.20 приведен типичный случай конку-

рентного ингибирования, представленный в форме графика ЛаЙнуивера-Бэрка. Скорость реакции (v)

измеряется при разных значениях концентрации S

и при фиксированной концентрации ингибитора.

Прямые, проведенные через экспериментальные точ­

ки, пересекаются в одной и той же точке на оси у.

Длина отрезка. отсекаемого от оси у, равна 1/ Vm~x;

это означает, что при бесконечно большой концентра­

ции S (1/IS) = О) v будет такой же, что и в отсутствие

ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого от

оси х (а эта величина определяет значение Км). в при­

сутствии ингибитора уменьшается (:-- 1/К'м < -1/Км)'

Таким образом, конк)'рентный ингибитор повышает кажущееся значение КМ (К'м) для субстрата. Для про­ стого конкурентного ингибирования длина отрезка,

отсекаемого от оси х, будет равна

Определив КМ в отсутствие 1. можно найти И3 этого уравнения K j • Если концентрация добавленного I

значительно превышает концентрацию фермента, то

можно считать [1] равной концентрации добавленно­

го ингибитора.. Значения К, дЛЯ ряда аналогов суб­

страта (конкурентных ингибиторов) показывают, ка­ кой из них наиболее эффективен. Ингибиторы с наи­ меньшими К, даже при малых концентрациях могут оказывать сильное ингибирующее действие.

Многие лекарственные препараты. широко при­

меняющиеся в клинике, действуют как конкурентные

ингибиторы очень важных ферментов, функциони­ рующих как в микробных, так и в животных клетках.

Обратимое неконкурентное ингибирование

Как следует уже из самого названия, в этом слу­

чае конкуренция между S и 1 отсутствует. При этом

ингибитор обычно ничем не напоминает S и, как мо­

жно предположить, связывается с другим участком

фермента. Обратимые неконкурентные ингибиторы

понижают максимальную скорость, достижимую при

данном количестве фермента (понижают Vmax)' но, как правило, не влияют на Км• Поскольку 1 и S связы­

ваются с разными центрами, возможно образование

как комплекса Enz-I, так и комплекса Enz-IS. Комплекс Enz - IS тоже распадается с образова­

нием продукта, однако с меньшей скоростью, чем

Enz-S; поэтому реакция будет замедляться, но не

остановится. Таким образом, могут протекать сле-