6. Пункты плана диагностики

Из поступившего в лабораторию материала готовят мазки, окрашивают по Граму; одним из методов для выявления капсулы (методы Михина, Гимзы, Ольта и т. д.), а также сибиреязвенными люминесцирующими сыворотками. В окрашенных мазках из трупного материала возбудитель обнаруживают в виде крупных грамположительных палочковидных бактерий, располагающихся одиночно, парами, короткими цепочками. Концы палочек, обращенные друг к другу, резко обрублены, свободные концы закруглены, клетки окружены капсулой. В отдельных случаях, особенно в мазках из материала, полученного от свиней, форма клеток может быть нетипичной: короткие, толстые, изогнутые или зернистые палочки со вздутием в центре или на концевых частях бактерий.

Предварительный ответ в хозяйство, откуда поступил материал, дают немедленно по результатам микроскопического исследования.

Выделение и идентификация культуры возбудителя. Факульта­тивный анаэроб, температурный оптимум 35...37 "С, рН 7,2...7,4. С целью выделения культуры возбудителя исследуемый материал засевают в МПБ, на МПА или в бульон и агар Хоттингера и инкубируют в аэробных условиях 18...24 ч, а при отсутствии роста — до 48 ч.

На МПА anthracis формирует плоские, матово-серые, шероховатые, с отростками на краях колонии (R-форма), может образовывать и атипичные коло­нии без отростков. Края колоний R-формы под малым увеличением микроскопа имеют вид локонов, получивших название «львиная грива» . В МПБ рост возбудителя характеризуется образованием на дне пробирки рыхлого осадка при прозрачной питательной среде; после встряхивания осадок разбивается на хлопья. Если возбудитель выращивать на питательных средах, содержащих сыворотку крови, и в атмосфере с повышенным содержанием оксида углерода (IV), то на МПА образуются гладкие колонии S-формы, I и МПБ отмечают рост в виде диффузного помутнения среды.

В выросших культурах исследуют морфлогические и тинкториальные свойства клеток. В мазках, окрашенных по Граму, обнаруживают длинные цепочки из грамположительных типичных палочек; в мазках из культур на средах с диффузным ростом находят отдельные или парные палочки. На бессывороточных средах бактерии капсулу не образуют, на сывороточных средах возбудитель формирует капсулу, причем клетки в препарате в последнем случае чаще располагаются одиночно или парами.

При значительной контаминации материала посторонней микрофлорой (сырье животного происхождения, объекты внешней среды) посев делают на селективный агар следующего состава: расплавленный МПА — 100 мл, сульфат полимиксина М — 0,5 мл, невиграмон — 0,5 мл, ризеофульвин — 1 мл, моющее средство «Прогресс» — 10мл, фенол фталеинфосфат натрия — 0,1 мл; перемешивают, разливают по чашкам Петри. Через 18...24 ч культивирования на внутреннюю поверхность крышки чашки Петри наносят 1...2мл 25%-го водного раствора аммиака, чашку переворачивают. Колонии В. anthracis остаются бесцветными, колонии бактерий с фосфатазной активностью розовеют.

Биопроба. Заражение лабораторных животных исходным материалом — обязательный этап, проводимый сразу после поступления материала в лабораторию. Тканевой суспензией заражают подкожно двух белых мышей по 0,2...0,5 мл или морских свинок по 0,5...2 мл. Наблюдение ведут в течение 10 сут. При наличии возбудителя животные погибают обычно через 1...3сут. Павших животных исследуют с выделением культуры возбудителя.

Если в ходе указанных исследований выделена бактерия, типичная для В. anthracis по морфологическим, тинкториальным и культуральным свойствам, патогенная для лабораторных животных, то дальнейшие исследования не проводят и диагноз считают установленным.

В случае получения нечетких результатов при вышеизложенных исследованиях проводят дополнительные с целью дифференциации выделенной культуры от сходных сапрофитных бацилл, и в первую очередь от В. cereus. При этом определяют способность микроорганизма к капсулообразованию путем посева на сывороточные среды, патогенность для лабораторных животных в биопробе, чувствительность к пенициллину, сибиреязвенному бактериофагу, специфичность к сибиреязвенным люминесцирующим сывороткам, гемолитическую активность, наличие жгутиков.

Тест «жемчужного ожерелья» разработан для определения чувствительности выделенного микроорганизма к пенициллину. В две колбочки (пробирки) с расплавленным МПА (температура 45 50 °С) добавляют пенициллин из расчета 0,05...0,5 ЕД/мл и переносят в две чашки Петри, в третью чашку наливают обычный МПА. После застывания агара из него вырезают пластинки размером 1,5 см2, которые переносят на предметные стекла и помещают в чашки Петри. На каждую пластинку бактериологической петлей наносят исследуемую 3-часовую бульонную культуру. Чашки выдерживают 1...3ч в термостате. Затем посевы просмат­ривают под микроскопом с объективом х 40 и иммерсионной системой. Перед просмотром зону роста накрывают покровным стеклом. Сибиреязвенные микробы на МПА с пенициллином приобретают шаровидную форму, а цепочки — вид «жемчужного ожерелья». Спорообразующие сапрофитные аэробы в аналогичных условиях растут в обычной форме. На агаре без пенициллина сибиреязвенные микробы образуют длинные цепочки из типичных палочек.

Для определения чувствительности к сибиреязвенному бактериофагу культуру или материал засевают на скошенный МПА, затем на поверхность среды наносят каплю бактериофага в рабочем титре и посевы выдерживают при температуре 37...38°С 24 ч. В случае принадлежности культуры к В. anthracis на поверхности МПА в зоне нанесения бактериофага остается стерильная зона при наличии роста микроорганизма на остальных участках среды. Для идентификации В. anthracis методом люминесцирующих антител используют флуоресцирующую адсорбированную сыворотку, не дающую перекрестных реакций с антигенно-родственными сапрофитными бациллами.

Гемолитическую активность исследуемой культуры определяют посевом на 5%-й МПА или в МПБ.

Наличие жгутиков исследуют посевом в 0,3%-й МПА или методом «раздавленной капли».

Если для исследования поступил загнивший материал, который нельзя подвергать обычному бактериологическому исследованию, то диагноз ставят на основании обнаружения антигенов возбудителя в материале при помощи реакции кольцевой преципитации.

Материал экстрагируют физиологическим раствором (соотношение 1:10) путем кипячения в течение 30...40 мин (горячий способ). Экстракцию смеси тканевой суспензии и карболизированного физиологического раствора (соотношение 1 : 10) можно проводить в течение 16... 18 ч при комнатной температуре (холодный способ). Экстракт фильтруют через асбестовую вату и исследуют в РП.

Реакцию ставят методом «наслаивания» или «подслаивания». При «наслаивании» в преципитационную пробирку вносят 0,2...0,3 мл преципитирующей сыворотки и осторожно наливают (наслаивают) исследуемый экстракт таким образом, чтобы компоненты не перемешивались. При «подслаивании» в пробирку вначале вносят 0,2...0,3 мл экстракта, затем под него пастеровской пипеткой — равное количество сибиреязвенной преципитирующей сыворотки. Одновременно ставят контроли. Реакцию считают положительной, если через 1...2мин и не позже чем через 15 мин на границе между компонентами появился тонкий беловатый диск преципитации.

В ветеринарных лабораториях часто исследуют на сибирскую язву в РП кожевенно-меховое сырье. В лабораторию доставляют пробы кожевенного сырья в виде небольших квадратиков (или кружков), взятых от шкур в местах, вырез которых не снижает товарной ценности. Эти пробы нанизывают на тонкую проволоку в том порядке, в котором шкуры расположены на складе. Поступившие пробы обязательно стерилизуют автоклавированием при 1,5 атм. 30 мин. Затем пробы измельчают и берут навески: 1 г — от парного, мороженого, пресно-сухого и сухосоленого сырья и 2 г —от мокросоленого. Пробы заливают экстрагирующей жидкостью (физиологический раствор, содержащий 0,3 % кристаллического фенола).

Пробы сырья от всех видов животных экстрагируют холодным способом при комнатной температуре в течение 16...20 ч; пробы от свиных шкур кипятят 30 мин. Экстракты фильтруют через асбестовую вату до прозрачности (предварительно взболтав содержимое баночек с пробами). Компоненты соединяют методом «наслаивания» или «подслаивания».

Контроли РП. 1. Контроль преципитирующей сыворотки: а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (результат положительный в течение 1...2 мин); б) с экстрактом из заведомо благополучных боенских кож (результат отрицательный в течение 1 ч); в) с экстрагирующей жидкостью (результат отрицательный в течение 1ч). 2. Контроль асбестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии асбестовой ваты).

Учет результатов РП проводят через 10... 15 мин для пресно-сухого (одиночные пробы), через 30 мин —для пресно-сухого (сдвоенные пробы) и сухосоленого (одиночные пробы), через 60 мин — для сухосоленого (сдвоенные пробы) и мокросоленого сырья.

При исследовании на сибирскую язву свежего тканевого мате­риала, а также при идентификации выделенных культур можно использовать реакцию диск преципитации, которая основана на взаимодействии продуктов метаболизма возбудителя (антиген), растущего в жидкой питательной среде, с антителами преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

В стерильную бактериологическую пробирку вносят 0,5... 1 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, на ее поверхность осторожно (по стенке пробирки) наслаивают расплавленный (45...50°С) 1%-й агаровый гель столбиком высотой 5...7 мм. Далее на поверхность застывшего агара наливают 1... 1,5 мл жидкой питательной среды (МПБ, среда ГКИ и т. д.) и в нее делают посев исследуемого тканевого материала или идентифицируемой культуры микроорганизма.

Посевы выдерживают при 37...38 °С 16...20 ч. Результаты учитывают, просматривая пробирку в проходящем свете на черном фоне. В положительном случае в средней части столбика агароного геля обнаруживают тонкую белую четкую линию (диск) пре­ципитации. Сапрофитные бациллы при росте в этой системе преципитации не дают. Некоторые штаммы В. cereus могут вызывать в нижней части агарового столбика образование рыхлой толстой зоны преципитации, которая за 30...40ч разрыхляется и сливается с преципитирующей сывороткой.