6.1. Адсорбционная жидкостная хроматография

В адсорбционной жидкостной хроматографии (ЖАХ) удерживание анализируемого вещества объясняется на основе так называемой “конкурентной модели”, согласно которой твердая поверхность покрыта

молекулами подвижной фазы, и молекулы образца вынуждены конкурировать с молекулами, расположенными в этом адсорбированном слое, за связывание с центрами адсорбции. Сильно адсорбирующиеся на поверхности растворители трудно заместить, и поэтому их относят к “сильным растворителям”, снижающим время удерживания анализируемого вещества. В то же время растворители, слабо взаимодействующие с

неподвижной фазой, заместить легко, и поэтому они выступают в качестве “слабых растворителей”. Ясно, что, согласно “конкурентной модели”,

удерживание в ЖАХ определяется именно различием между сродством подвижной фазы и образца к неподвижной фазе.

Было предложено следующее уравнение* для количественного описания упомянутого эффекта конкурирования:

lgK_a=lgV_a+(S°_i —A_i⁰). (31)

В этом уравнении K_a — константа распределения анализируемого вещества; S°_i — энергия адсорбции образца на стандартном адсорбенте; V_a — объем адсорбированного растворителя в расчете на грамм неподвижной фазы; A_i—площадь, занятая адсорбированной молекулой образца;  — активность сорбента; ⁰—удельная энергия адсорбции растворителя (энергия адсорбции, отнесенная к единице площади поверхности) на том же стандартном адсорбенте, которую обычно называют силой растворителя или элюирующей силой.

Отношение факторов удерживания для молекул анализируемого вещества, которое получено на двух подвижных фазах различной силы ( ⁰₁ и ⁰₂) может быть представлено следующим выражением:

(k₂/k₁) =  A_i (⁰₁ –⁰₂) , (32)

Параметр ° позволяет также оценить полярность растворителя (см. таблицу 6).

6.2. Хроматография “жидкость-жидкость”

В хроматографии “жидкость-жидкость” более полярные молекулы подвижной фазы “выталкивают” менее полярные молекулы анализируемого вещества к поверхности сорбента. Так как современная жидкостная хроматография в большинстве разделений использует воду, то для меры этого выталкивания используют термин “гидрофобность”. У поверхности сорбента, смеси анализируемых веществ делятся по аналогии с газо-жидкостной хроматографией с неполярными фазами, то есть позже выходят последние члены гомологического ряда.

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) использует неполярную неподвижную фазу и полярную подвижную фазу. Нормально-фазовая жидкостная хроматография (НФЖХ) применяет неполярную подвижную фазу (н-гексан) и полярную неподвижную фазу.

В распределительной жидкостной (и газовой) хроматографии время удерживания зависит от длины (объема) колонки, линейной (объемной) скорости подвижной фазы (u) и фактора удерживания k (см. уравнение 3).

Фактор удерживания зависит от отношения объемов неподвижной V_S и подвижной фаз V_M и константы распределения K (уравнение 2).

Фактор удерживания может быть выражен через параметры растворимости подвижной (_m) и неподвижной фаз (_s).

lnk _i = (_i /RT)[lnV_S/V_m+{(_i -_m)² - (_i -_S) ²}], (33)

где _i= (E_Vi/_i)^1/2 ; _i –молярный объем анализируемого вещества (сорбата); E_Vi – энергия когезии анализируемого вещества; R –универсальная газовая постоянная; T – температура; V_S/V_m —соотношение объемов неподвижной и подвижной фаз.

Время анализа принято считать оптимальным, если компоненты анализируемой смеси элюируют из колонки при значении k в пределах от 2 до 10.

Это уравнение можно переписать в виде*:

lnk _i = (_i /RT)[lnV_S/V_m +{(_m+_s-2_i) (_m-_s)}]

Если каждую из круглых скобок приравнять нулю, то получим:

Bариант А: (_m-_s)0 _m=_s

Bариант Б: (_m+_s-2_i 0  _i =(_m-_s) /2.

Можно выбрать подвижную и неподвижную фазы (Bариант A) примерно одинаковой полярности (т. е. _m_s). Если при этом наблюдается желаемое воздействие на удерживание, полярность исследуемых образцов не играет никакой роли, и, следовательно, такой подход приводит к получению весьма неселективной фазовой системы.

В варианте Б полярность образца примерно равна половине суммы полярностей подвижной и неподвижной фаз:

 _i  (_m+_s)/2

Рисунок 22. Выбор фазовых систем для жидкостной хроматографии.

Три горизонтальные оси (сверху вниз) представляют собой параметры растворимости неподвижной фазы (_s), анализируемого образца (_i) и подвижной фазы (_m). На рисунке изображены две линии, иллюстрирующие два примера выбора возможных фазовых систем для элюирования образца с _i=12. Нормально-фазовой (НФЖХ) системе отвечает линия с положительным наклоном, которая соединяет подвижную фазу малой полярности (например, н-гексан с _m = 7) с полярной неподвижной фазой (например, силикагель _s = 16).

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография (ОФЖХ) (распределительная хроматография) соответствует линии, которая соединяет типичную неполярную неподвижную фазу с _s = 7 с полярной подвижной фазой c _m =16. Такую подвижную фазу можно, например, получить, смешав метанол (_m 16) с водой (_m 25) в нужной пропорции. Наличие столь высокой полярности у воды делает обращенно-фазовую систему очень гибкой, так как эта система может перекрыть смешанными фазами (из метанола и воды или даже из тетрагидрофурана (_m 10) и воды очень широкий диапазон полярности подвижной фазы. Не меняя колонку с неподвижной фазой можно достигнуть элюирования различных анализируемых веществ. Фактор удерживания можно сдвинуть в оптимальный диапазон, выбрав подвижную фазу, еще чуть сильнее или слабее (таблица 6). Таким образом, уравнение зависимости фактора удерживания от параметров растворимости в подвижной и неподвижной фазах может служить хорошим (хотя и качественным) показателем поведения систем, используемых в жидкостной хроматографии.

В начальный период развития жидкостной хроматографии использовали сорбенты, приготовленные подобно сорбентам для газовой хроматографии. На частицы носителя механически наносили пленку неподвижной фазы с той или иной полярностью. К сожалению, колонки с такими сорбентами имели меняющиеся характеристики, и время их жизни было невелико.

При синтезе сорбентов для ВЭЖХ химическое взаимодействие

предпочтительней, чем физическое. Поверхность силикагеля обрабатывают различными хлорсиланами. При этом гидроксильные группы на его поверхности вступают в реакцию с этими хлорсиланами. Полученные продукты называют химически модифицированными кремнеземами. Количество нанесенной неподвижной фазы возрастает от С₂-С₃, до С₁₈ , то есть время удерживания возрастает приблизительно в два раза в ряду С₂→С₄→С₈→С₁₈. Если на силикагель привиты бутил, октил, октадецил, то есть неполярные группы, то такой сорбент используется в обращено-фазной хроматографии. Если привита полярная группа (например, аминогруппа), то такой сорбент используется в нормально-фазной хроматографии.

Использование параметра растворимости дает лишь приближенную оценку элюирующей силы растворителей, используемых в качестве подвижной фазы. Другую более точную оценку предложил для распределительной хроматографии Снайдер. Он ввел параметр полярности Р для распределительной хроматографии, который позволил количественно оценить полярность большинства растворителей (таблица 6).

В основе классификации полярности подвижной фазы в хроматографии жидкость-жидкость лежат экспериментально найденные значения констант распределения в хроматографии газ-жидкость. Для этанола (e), 1,4-диоксана (d) и нитрометана (n), а также н-октана () определены константы распределения для большого количества неподвижных фаз:

P = lg K_e’’ + lg K_d’’ + lg K_n’’ , (34)

При этом первый член (этанол; lg K_e’’) отражает вклад донора протонов, второй член (1,4-диоксан; lg K_d’’) отражает вклад акцептора протонов, третий член (нитрометан; lg K_n’’) отражает вклад “сильного дипольного взаимодействия”.

Значение фактора удерживания в зависимости от параметр полярности Р можно найти, используя уравнение (35):

lg(k₂/k₁) = (P₁ – P₂)/2. (35)

Чтобы получить оптимальной значение фактора удерживания пользуются обычно смесью растворителей. Полярность смесей растворителей можно рассчитать по формуле

Р_ij = Р_i N_i +Р_j N_j, (36)

где N_i и N_j - объемные доли.

При исследовании высокополярных и ионогенных соединений наблюдаются большая асимметрия пиков, слишком малое или очень большое удерживания таких соединений. Устранение этих явлений достигается введением в подвижную фазу в небольших количествах (0,01-2%) модификаторов. Модификаторы могут блокировать наиболее активные центры неподвижной фазы, могут

Таблица 6. Параметры растворителей высокоэффективной жидкостной хроматографии.

	Растворитель	Параметр раствори -мости 	Пара- метр Р	Элюи-рующая сила o	Вяз-кость, МПа
	Ацетонитрил	13.1-11.2	5.8	0.51	0.34
	Бензол	9.2	2.7	0.25	0.60
	Вода	25.5-21.0	10.2	1.50*	0.89
	Гексан	7.3	0.01	0.01	0.30
	Диметилформа- мид	11.5	6.4	1.00	0.80
	Диоксан	10.6-9.8	4.8	0.50	1.20
	Дихлорэтан	9.7	3.5	0.20	0.78
	Изооктан	7.0	0.01	0.01	0.47
	Метанол	15.8-12.9	5.1	0.72	0.54
	Метилэтилкетон		4.7	0.40	0.38
	Изопропанол	12.4	3.9	0.60	1.90
	Тетрагидро-фуран	9.9	4.0	0.53	0.46
	Хлороформ	9.1	4.1	0.26	0.53
	Этилацетат	8.6	4.4	0.40	0.43

Рисунок 23. Изменение формы пика и времени удерживания компонента на хроматограмме при увеличении его концентрации.

подавлять ионизацию сорбата, могут направлять сорбцию по наиболее выгодному в данном случае механизму. В качестве модификаторов для вводно-органических подвижных фаз используют соли, кислоты, основания. Использование алкилсульфатов натрия (0,001-0,01 моль/л) при рН 2-5 переводят обычную обращено-фазовую хроматографию в так называемый ион-парный режим. То же самое происходит при использовании фосфата тетрабутиламмония и бромида цетилтрибутиламмония.