Контрольные вопросы

1. Назовите бактерии, сбраживающие целлюлозу.

2. Как провести опыт по брожению целлюлозы?

3. Как приготовить препарат целлюлозоразлагающих анаэробов для микроскопического изучения?

4. Чем отличаются возбудители процесса разложения клетчатки в аэробных условиях от возбудителей этого процесса в анаэроб­ных условиях?

Лабораторная работа №9 Денитрификация

Цель работы: изучить процесс денитрификации и микроорганизмы, участвующие в нем.

Связанный азот, необходимый для растений, удаляется из почвы в процессе денитрификации, идущем с освобождением газообразного азота. Восстановление окисленных форм азота - нитратов и ни­тритов - до газообразных азотных соединений называют денитрификацией.

Денитрификация осуществляется микроорганизмами в ана­эробных условиях и ингибируется кислородом воздуха. Нитраты в ана­эробных условиях выполняют роль акцепторов электронов, которые поступают от окисляемых соединений - органических или неоргани­ческих. В тех случаях, когда донорами электронов служат органиче­ские соединения, денитрификацию осуществляют хемоорганогетеротрофы, а если неорганические — хемолитоавтотрофы. В процессе денит­рификации участвуют ферменты, содержащие молибден (FeS-белки - нитратредуктаза А и нитритредуктаза), локализованные на клеточ­ных мембранах. Начальный этап восстановления нитратов при де­нитрификации катализуется ферментом нитратредуктазой А. Синтез данного фермента в клетках бактерий в присутствии нитрата идет только в анаэробных условиях. В аэробных условиях нитратредукта­за А не образуется.

Конечными продуктами денитрификации могут быть N₂,N₂О и NO:

NO₃ → NО₂→ NO→ N₂O → N₂

Способностью к нитратному дыханию обладает большое чис­ло родов бактерий. Первый этап процесса - восстановление нитра­тов в нитриты - идет при участии разнообразных микроорганиз­мов, как прокариот, так и эукариот (водоросли, грибы и дрожжи). Полное восстановление нитратов до газообразных продуктов (NO, N₂О, N₂) могут осуществлять только прокариоты. Процесс этот осуществляют денитрифици­рующие бактерии, в основном родов Pseudomonas и Паракоккус - Paracoccus. В наибольшей степени способность к полному восстановле­нию нитратов распространена у представителей родов Pseudomonas (P. fluorescens, P. stutzeri, P. aeruginosa) и Bacillus (В. licheniformis и др.). К хемолитоавтотрофным бактериям-денитрификаторам отно­сят Thiobacillus denitrificans, Thiomicrospira denitrificans, Paracoccus denitrificans.

Денитрифицирующие бактерии - факультативно анаэробные организмы, способные восстанавливать нитраты только в анаэроб­ных условиях. В присутствии свободного кислорода эти бактерии переходят на аэробное дыхание (обладают полной дыхательной сис­темой), а нитраты потребляют лишь как источник азота (ассимиля­ционная нитратредукция). Некоторые денитрификаторы способны и к процессу азотфиксации.

С планетарной точки зрения этот процесс имеет решающее значение для сохранения жизни на земной суше. Без денитирификации земной и атмосферный запасы азота сосредоточились бы в виде солей в океане. В результате микробиологической денитрификации в атмос­феру ежегодно поступает из почв и водоемов 270-330 млн. т азота. Особенно существенен этот процесс в переувлажненных почвах, а также в тех случаях, когда минеральные азотные удобрения вносят в форме нитратов совместно с навозом или другими органическими удобрениями.

Денитрификация в почве приводит к потере минеральных азотных соединений, нужных для растений, что наиболее су­щественно сказывается на переувлажненных почвах, а также при внесении минеральных азотных удобрений совместно с органическими.

Задание: изучить процесс денитрификации и микроорганизмы, участвующие в нем.

Материалы и оборудование: Питательная среда для денитрифицирующих бактерий, свежая почва, чайная ложка, пипетки на 1 мл, приборы и оборудование для проведения опыта.

Методика проведения работы

При изучении процесса денитрификации используют сре­ду Гильтая или жидкую среду следующего состава (в г на 1 л дистиллированной воды): KNH₄HPО₄ (сегнетова соль) - 20; KNО₃ - 2,0; К₂НРО₄ - 0,5; MgSО₄ - следы.

В склянку емкостью 100-150 мл наливают немного пита­тельной среды и к ней добавляют ¹/₃ чайной ложки почвы. Среду перемешивают с почвой, чтобы вышли пузырьки воз­духа; затем склянку наполняют питательной средой до края и закрывают каучуковой пробкой. В пробку вставляют от­крытую с двух сторон стеклянную трубку с расширением в средней части. Вытесняемая жидкость входит в трубку. В сосуде под пробкой создаются анаэробные условия. Прибор со средой помещают в термостат при 28-30 °С.

После 5-6 дней инкубации проводят культуральный анализ. Отмечают появление пузырьков газа (СО₂ и N₂) под пробкой.

Для знакомства с возбудителями процесса из середины субстрата берут каплю и готовят фиксированный и окрашен­ный препарат, который рассматривают под микроскопом с им­мерсионной системой. Результаты опыта записывают, а возбу­дителей процесса денитрификации (Pseudomonas stutzeri, Micrococcus denitrificans и др.) зарисовывают.