Глава II. Материалы и методы исследования

Эффективность лечения туберкулеза, лейкоза и борьбы с внутрибольничным заражением пациентов лекарственно-устойчивыми штаммами МБТ реша­ющим образом зависит от скорости обнаружения возбудителя, его иденти­фикации и определения лекарственной чувствительности. До последнего времени для этой цели использовали только классический метод посева анализируемого материала на плотные питательные среды, содержащие чистые субстанции основных противотуберкулёзных препаратов (ПТП) в стандартных концетрациях. Этот метод считается «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза и используется практически во всех противо­туберкулезных учреждениях России. Для учреждений Российской Фе­дерации применение метода регламентировано приказом Министерства здравоохранения РФ №109 от 2003 г. Однако ответ о наличии возбудите­ля и его лекарственной чувствительности при использовании этого метода может быть получен не ранее 6-8 недель и чаще всего больным назначают ПТП независимо от того, каким по лекарственной чувствительности штам­мом они заражены, хотя подбор схемы лечения с учётом характера устой­чивости МБТ, в значительной степени определяет ее эффективность.

Применение автоматизированных систем с использованием жид­ких сред - Bactec MGIT 960 (Becton Dickinson) или BacT/Alert 3D (BioMerieux) сокращает время обнаружения возбудителя до 1-2 недель, определение чувствительности МБТ к ПТП 1-го ряда продлевает время анализа еще на 1-2 недели.

Принципиальное решение проблемы быстрого обнаружения, иденти­фикации возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чув­ствительности было найдено в результате разработки технологии биоло­гических микрочипов.

Идея создания биологического микрочипа возникла в конце 1980-х годов одновременно в Великобритании, Югославии и СССР. В Советском Союзе эти работы были инициированы и проводились в Институте моле­кулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН под руководством выдаю­щегося ученого, академика А.Д. Мирзабекова. В 1999 году американская газета «Sunday Times» опубликовала имена 20 ученых, работы которых окажут наибольшее влияние на развитие технологий XXI века. Возглав­лял этот список академик РАН А.Д. Мирзабеков - «русский изобретатель первого в мире биочипа, который революционизирует медицинскую диа­гностику».

Суть этой технологии заключается в следующем. Биочип представ­ляет собой подложку с ячейками, в каждой из которых иммобилизована (закреплена) индивидуальная биомолекула, служащая зондом для про­ведения реакции с целью распознавания определенной мишени в ана­лизируемом образце. Зонды расположены в определенном порядке и взаимодействуют с исследуемым образцом по принципу «ключ-замок». В ячейке биочипа, в которой возникло соответствие (комплементарность) между зондом и фрагментом анализируемой молекулы-мишени, образует­ся устойчивый комплекс, регистрируемый с использованием специального оборудования. Распределение ячеек биочипа в виде изображения (карти­ны) является индивидуальной характеристикой анализируемого образца.

Первые биологические микрочипы появились в конце прошлого века, а сейчас уже десятки компаний выпускают различные типы чипов, отли­чающихся друг от друга по методике изготовления и по методу, с помощью которого регистрируют результат взаимодействия чипа с образцом.

В основе технологии биочипов, разработанной под руководством А.Д. Мирзабекова, зонды располагаются не на плоской поверхности подложки, а в трехмерном объеме специального геля.

Биочип, содержащий трехмерные ячейки, обладает существенными преимуществами по сравнению со стандартными двумерными чипами.

Взаимодействие исследуемых образцов с зондами, иммобилизован­ными в геле, имеет больше сходства с процессами, протекающими в рас­творе, чем в том случае, когда иммобилизованные зонды находятся на по­верхности стекла, вследствие чего достигается высокая специфичность их взаимодействия с молекулами из анализируемого образца. Каждая ячей­ка содержит гораздо большее количество молекул зонда по сравнению с зондами, прикрепленными к двумерной поверхности. В водном окружении молекулы сохраняют свою активность, с ними можно проводить любую ферментативную реакцию. Трехмерные биочипы позволяют изучать кине­тику и термодинамику реакций, протекающих в индивидуальных ячейках, в том числе образование дуплексов нуклеиновых кислот.