Основные ферменты ги

Рестриктазы (эндодезоксирибонуклеазы) – ферменты, расщепляющие ДНК на отдельные, довольно короткие нуклеотидные последовательности. Известно около 400 рестриктаз.

Естественная функция – защита бактерии от инфекции вирусами и ограничение скрещивания между различными бактериальными видами.

Первая рестриктаза выделена в 1968г. М. Мендельсоном и Р. Юань из E. coli.

Номенклатура рестриктаз

1. К первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида: Escherichia coli – Eco.

2. В случае необходимости обозначают серотип или штамм: ЕсоВ

3. Рестриктазы, полученные из клеток одного и того же вида, обозначаются римскими цифрами в порядке их выделения: ЕсоКI.

4. Ферменты системы рестрикции-модификации в общем виде обозначаются как эндонуклеаза (R) или метилаза (М) перед названием фермента: R·HindII (Haemophilus influenzae).

5. После родо-видового названия указывается символ внехромосомного элемента, если фермент генетически локализован в геноме фага или на плазмиде. Штаммовая принадлежность тогда указывается в скобках: Eco(K)PI.

Исходя из закономерностей функционирования рестриктазы разделяют на три класса. В основе классификации: потребность в кофакторах и характер расщепления ДНК.

Рестриктазы класса I

Наиболее изучены: ЕсоК и ЕсоВ. Содержат три типа неидентичных субъединиц: α субъединица - Расщепление ДНК

β субъединица - Метилирование ДНК

γ субъединица - Узнавание специфической последовательности

Субстрат: немодифицированная двухцепочечная ДНК.

Узнаваемая последовательность: непалиндромная структура

Кофактор: АТФ (расщепление ДНК сопряжено с гидролизом АТФ)

цАМФ

Mg²⁺

Особенности: 1) узнавание строго специфичных последовательностей

2) разрыв ДНК происходит случайным образом на значительном расстоянии от участка узнавания – от 400 до 7000 пар нуклеотидов

3) продукты расщепления ДНК гетерогенны

Модель действия: 1) взаимодействие с ДНК в участке узнавания

2) осуществление АТФ-зависимой транслокации (перемещение) цепей ДНК через себя в обоих направлениях

3) Разрезание двухцепочечной ДНК при встрече двух соседних молекул фермента в районе контакта.

Гетерогенность продуктов гидролиза ДНК связана с неодновременным началом транслокации цепей ДНК и неравномерной транслокацией цепей на разных молекулах.

Рестриктазы класса II

Можно выделить в индивидуальном состоянии, свободном от метилазной активности, что упрощает их изучение и использование. Состоят из двух субъединиц одного типа со сравнительно небольшой молекулярной массой.

Субстрат: немодифицированная двухцепочечная ДНК.

Кофактор: Mg²⁺

Узнаваемая последовательность: палиндромная структура (4-8 пн)

Палиндром это последовательность- перевертыш, идентичная в обеих цепях при прочтении в направлении от 5' к 3'. Палиндромные последовательности, которые узнаются рестриктазами класса II и в которых происходит расщепление ДНК, называются сайтами узнавания. Участки полинуклеотидной цепи, в которых происходит разрезание молекулы ДНК, называются сайтами рестрикции. Для EcoRI сайт узнавания – GAATТC, сайт рестрикции – GA. Расщепляется связь между атомами кислорода при 3' атоме углерода в дезоксирибозе одного нуклеотида и фосфатной группой, присоединной к 5' углеродному атому сахара другого нуклеотида.

Ряд рестриктаз расщепляет ДНК строго по оси симметрии узнаваемой последовательности и образует фрагменты ДНК с тупыми концами, то есть не имеющие выступающих одноцепочечных участков.

Если же разрывы в цепи ДНК располагаются наискось друг от друга, в результате образуются одноцепочные комплементарные концы, называемые липкими концами. При смешивании разных препаратов таких фрагментов ДНК в определенных условиях липкие концы могут реассоциировать, т.е. слипаться за счет комплементарных взаимодействий.

Для поддержания высокой специфичности in vitro необходимо создавать оптимальные условия в реакционной смеси. При нарушении этих условий у некоторых рестриктаз проявляется вторичная (т.н. штриховая) активность. Так рестриктаза EcoRI расщепляет последовательность GAATTC при рН 7.3, 100 мМ NaCl в присутствии 5мМ MgCl₂. При снижении рН, понижении концентрации NaCl и замене ионов магния на ионы марганца, а также в присутствии органических растворителей фермент может расщеплять более короткую последовательность AATT.

В клетках прокариот присутствует спермидин – полиамин, значительно повышающий точность гидролиза ДНК.

Прототипы – рестриктазы, узнающие ранее неизвестные последовательности.

Изошизомеры – ферменты, выделенные из различных микроорганизмов, узнающие одну и ту же последовательность и образующие одинаковый спектр фрагментов ДНК (истинные). Если при этом образуются разные фрагменты, изошизомеры называют ложными.

Внутри этого класса выявлены ферменты, которые in vivo расщепляют только метилированные двухцепочечные молекулы ДНК, а также ферменты, узнающие непалиндромные структуры и расщепляющие ДНК на строго фиксированном расстоянии от участка узнавания с образованием как тупых, так и липких концов.

ЗАДАЧА:

Пространственная разобщенность участков узнавания и расщепления ДНК для некоторых рестриктаз позволила разработать методику расщепления одноцепочечной ДНК в любом выбранном участке:

Синтезируем олигонуклеотид, на одном конце которого находится взаимокомплементарная последовательность, способная образовывать двухцепочечную шпильку. В шпильке располагается участок узнавания рестриктазы. Второй конец олигонуклеотида комплементарен выбранному району одноцепочечной ДНК и может образовывать с ней комплекс.

Обработка комплекса соответствующей рестриктазой позволяет произвести разрез в выбранной точке одноцепочечной ДНК.

Применение рестриктаз класса II

1. Рестрикционное картирование – метод, используемый для анализа структуры ДНК и составления хромосомных карт. На рестрикционной карте отмечено относительное расположение участков (сайтов рестрикции), которые вырезают различные нуклеазы. С помощью других методов можно сопоставить эту карту с генетической картой. В данном случае применяют технологию электрофореза, с помощью которой разделяют ДНК на фрагменты и определяют их относительный размер.

Пример: Предположим, мы выделили ДНК вируса длиной в четыре килобазы (kb) и порезали ее ферментом ЕсоRI на фрагменты. Пропустив их через гель, мы определили их длину: 0,4; 0,8; 1,3 и 1,5 kb. Это значит, что в геноме находится четыре участка рестрикции EcoRl, которые могут располагаться по-разному.

Порежем вирусную ДНК снова при помощи EcoRI, но на этот раз уменьшим время обработки ДНК ферментом, чтобы некоторые ДНК были порезаны не полностью. Наряду с прежними четырьмя фрагментами получаем новые фрагменты длиной 1,7; 1,9; 2,1 и 2,3 kb. Небольшой перебор вариантов показывает, что эти фрагменты располагаются в следующем порядке: 1,5 0,4 1,3 0,8. Если полученных данных недостаточно для определения взаимного расположения участков, то можно еще раз порезать фрагменты одним ферментом, а затем другим. После этого можно применить третий фермент и определить расположение его участков рестрикции относительно первых двух.

2. Создание рекДНК: Если два разных образца ДНК обрабатывают одной и той же рестриктазой, с образованием фрагментов с липкими концами, а затем смешивают эти образцы, то благодаря комплементарному спариванию липких концов фрагментов разных образцов, могут образоваться новые комбинации генов – рекомбинантные ДНК.

Рестриктазы класса III

Имеют некоторое сходство с рестриктазами класса I. Состоят из двух различных субъединиц, одна из которых обладает рестриктазной, а другая – метилазной активностью.

Кофакторы: АТФ и Mg²⁺

Расщепление ДНК не сопровождается гидролизом АТФ. цАМФ ускоряет реакцию.

Узнают несимметричные последовательности нуклеотидов длиной 5-6 нуклеотидных пар и расщепляют ДНК в стороне от участков узнавания на расстоянии 24-27 пар нуклеотидов. При этом образуются одноцепочечные 5'-концы длиной 2-3 нуклеотида.

При действии ферментов данного класса in vitro не удается исчерпывающе гидролизовать ДНК. Причины этого пока не ясны.

ДНК-МЕТИЛАЗЫ (ДНК-метилтрансферазы)

Обычно каждую рестриктазу сопровождают метилазы. Различают сайт-специфические метилазы, сопряженные с рестриктазами, и метилазы, используемые клетками про- и эукариот для различных регуляторных целей. Метилазы первого типа вместе с рестриктазами составляют т.н. RM-систему (систему рестрикции-модификации) и механизм их действия заключается в переносе метильной группы с S-аденозил-L-метионина на определенные остатки цитозина с образованием 5-метилцитозина, или аденина, с образованием N₆ –метиладенина (эукариотическая ДНК не метилируется в это положение) После метилирования, приводящего к модификации ДНК, многие рестриктазы (например EcoRI, в состав сайтов рестрикции которых входит данная метилированная последовательность), перестают расщеплять ДНК по этим сайтам.

RM-cистема представляет собой совокупность двух конкурирующих процессов, результатом которых является:

1. Защита собственной ДНК от расщепления

2. Защита клеток от инфицирования фагами

3. Ограничение скрещивания между различными видами бактерий

Большинство штаммов E. coli содержит два типа ферментов, метилирующих ДНК: Dam- и Dcm-метилазы, не связанные с RM-cистемой. Первая осуществляет перенос метильных групп в N-положение аденина в последовательности GATC. Dcm-метилаза, осуществляет метилирование остатков цитозина по положению С5 в последовательностях C^meCAGG и C^meCTGG. Для того чтобы избежать нежелательного влияния этих метилаз на клонируемые ДНК, в качестве хозяев используют мутантные штаммы E. coli: dam^- и dcm^- (так обозначаются штаммы, лишенные этих метилаз). ДНК-метилазы бактериальных RM-систем применяют для блокирования in vitro соответствующих сайтов рестрикции на исследуемых фрагментах ДНК с целью получения ДНК больших размеров.

ДНК млекопитающих и высших растений часто содержит остатки 5-метилцитозина в CG-последовательностях. Такая ДНК не расщепляется теми из рестриктаз, которые содержат подобные последовательности в сайтах узнавания и чувствительны к такому характеру метилирования. Такие последовательности можно расщепить, используя изошизомеры с другим типом метилирования. В клетках эукариот есть участки ДНК, в которых частота CG намного выше, чем в других участках (т.н. островки CG). Они локализованы вокруг регионов, с которых считывается особо важная информация для клеточных функций. В этих регионах CG последовательности не метилируются. В противоположность этому, последовательности CG в неактивных генах метилированы, что ингибирует их экспрессию, т.е. считывание с них генетической информации.

Бактерия-хозяин может метилировать ДНК вируса и тем самым предотвратить его размножение.

ДНК-ЛИГАЗЫ

Наиболее универсальным является ДНК-лигаза фага Т4, катализирующая образование фосфодиэфирной связи между прилегающими 5'-фосфатным и 3'-гидроксильным концами цепей ДНК. Представляет собой мономерный полипептид с М=68000.

Кофакторы: АТФ, Mg²⁺

Активность: Лигирование липких и тупых концов.

Субстраты: 1)Двухцепочечные молекулы ДНК с комплементарными липкими концами, которые спариваются друг с другом и соединяются 3'-ОН и 5'-фосфатными концевыми группами.

2) ДНК с одноцепочечными разрывами

3) Двухцепочечные ДНК с 5'-фосфатным и 3'-ОН-тупыми концами в высоких концентрациях

Применение:

1. Сшивание молекул ДНК с совместимыми липкими концами.

2. Сшивание двухцепочечных молекул ДНК с тупыми концами друг с другом или с синтетическими линкерами. Активность ДНК-лигазы фага Т4 по оотношению к молекулам ДНК с тупыми концами может быть повышена примерно в 20 раз при добавлении РНК-лигазы фага Т4

ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в ГИ находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент (фрагмент Кленова), ДНК-полимераза фага Т4 и в последнее время термостабильные ДНК-полимеразы.

ДНК-полимераза I E. coli катализирует матричный синтез ДНК только в направлении 5'→3'.

ДНК-полимераза I E. coli - белок с мол. массой 109 килодальтон, обладающий тремя видами активности. В отличие от РНК-полимеразы, которая может синтезировать новую цепь, ДНК Pol I может расширять только существующую цепь. Поэтому, чтобы синтезировать молекулу ДНК, требуется наличие короткой РНК (а не ДНК) молекулы (5-12 нуклеотидов) со свободной 3'ОН – группой. Ее называют затравочной цепью или праймером. В живых клетках синтез праймера осуществляется ферментом праймазой, а в генной инженерии применяется, как правило, готовый продажный праймер.

1. Полимеразная активность в направлении 5ґ→ 3ґ. Синтез осуществляется на однонитевой матричной ДНК, в присутствии +дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP) путем присоединения нуклеотидных остатков к 3'ОН - концу комплементарной нити, являющейся в таком случае праймером. В этой реакции фермент катализирует образование фосфодиэфирной связи. За один цикл синтезируется лишь короткая цепь ДНК длиной в 10-50 нуклеотидов.

праймер

5ґ-AAGTT- 3ґ + Pol, (dNTP) →5ґ-AAGTTCCGATGG- 3ґ

3ґ-TTCAAGGCTACC- 5ґ 3ґ-TTCAAGGCTACC - 5ґ

матричная ДНК

2. Экзонуклеазная активность в направлении 5'→ 3' вызывает отщепление нуклеотидов c 5'-концов двунитевых ДНК и приводит к их деградации. Т.е происходит процесс обратный полимеризации. Эта активность может быть использована для удаления праймера.

3. Экзонуклеазная активность в направлении 3'→ 5' приводит к отщеплению нуклеотидов с 3' ОН – концов одно и двунитевых молекул ДНК. Это процесс протекает в 10 раз медленнее, чем полимеразная реакция. На двунитевой ДНК в присутствии нуклеозидтрифосфатов экзонуклеазная активность фермента подавляется полимеразной активностью. При помощи такой активности фермент может удалять неправильно вставленное основание, выполняя роль корректора, т.к. диэфирная связь расщепляется только в неспаренных участках ДНК.

Все три активности локализуются в разных участках фермента:

N-концевой домен - 5'→ 3' экзонуклеазная активность

С-концевой домен - 5'→ 3' полимеразная

Средний - 3'→ 5' экзонуклеазная

Чтобы устранить экзонуклеазную активность в направлении 5ґ→ 3ґ, которая может приводить к нежелательному расщеплению ДНК, с помощью фермента трипсина был отделен большой фрагмент, у которого отсутствует эта активность (фрагмент Кленова). В настоящее время фрагмент Кленова получают прямо из специально сконструированного штамма бактерий.

ДНК-полимераза I одновременно может вести реакцию полимеризации и гидролиз нуклеотидной цепи в направлении 5'→ 3', начиная с однонитевого разрыва (nick-ника- зарубки, разрыва) в двухнитевой ДНК. При этом НИК перемещается вдоль цепи ДНК в направлении 5'→ 3' на расстояние 1000 пар нуклеотидов. Процесс называется ник-трансляцией. Путем ник-трансляции ДНК-полимераза и ее фрагмент могут быть использованы для введения в синтезируемые цепи ДНК радиоактивно меченых дезоксирибонуклеотидов.

При этом одноцепочный разрыв перемещается вдоль двуцепочной ДНК, а 3'-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов. При этом ДНК-полимераза прокладывает себе путь с помощью 5'→ 3'- экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца.

Фрагмент Кленова используют также для синтеза второй цепи ДНК, секвенирования ДНК по методу Сенгера, заполнения 5'-выступающих липких концов ДНК с образованием тупых концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3'→ 5'- экзонуклеазой этого фермента.

ДНК-полимераза фага Т4.

Эта полимераза обладает той же активностью, что и фрагмент Кленова, т.е. лишена 5'→ 3'- экзонуклеазной активности. В то же время 3'→ 5'- экзонуклеазная активность, особенно на однонитевой ДНК, у нее выше, чем у ФК в 200 раз. Это позволяет использовать Т4-ДНК-полимеразу для введения радиоактивной метки путем реакции обмена немеченного 3ґ- концевого нуклеотида на меченный радиоактивный изотоп.

Экзонуклеазная активность проявляется при отсутствии в среде нуклеотидов, полимеразную активность инициируют, добавляя в среду меченые радиоактивным изотопом нуклеотиды.

Задача: осуществить гидролиз сегмента ДНК с известной последовательностью до строго определенной точки, например, до инициаторного ATG-триплета структурного гена.

1. Синтезируем праймер, соответствующий началу этого гена.

2. Осуществляем денатурацию сегмента ДНК, содержащего изучаемый ген.

3. Вводим избыток синтетического праймера. При этом образуются комплексы между праймером и комплементарной цепью сегмента.

4. Обрабатываем ДНК фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I:

-одноцепочечный 3'-конец дуплекса удаляется (3'→5'- экзонуклеазная активность)

-цепь на 5'-конце достраивается с помощью 5'→ 3' полимеразной активности.

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПТАЗА

РНК-зависимая ДНК-полимераза способна осуществлять синтез ДНК на матрице РНК, используя четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата. Ревертазы, как и ДНК-полимеразы действуют только при наличии затравки. Наиболее изучена ревертаза ретровирусов птиц.

Активность: ДНК-полимеразная – в качестве матрицы как ДНК, так и РНК

РНКаза Н – гидролизует РНК в составе гибрида РНК-ДНК (но не одиночную РНК)

ДНК-эндонуклеазная – для интеграции вирусной ДНК в геном клетки

Применение: транскрипция матричногй РНК в комплементарную ДНК (кДНК). Реакцию проводят в присутствии сильных ингибиторов РНКазной активности.

Концевое включение метки в фрагментыДНК с выступающими 5'-концами.

НУКЛЕАЗА BAL31

Активность: эндодезоксирибонуклеаза (экзонуклеаза) на двухцепочечной ДНК с тупыми или выступающими концами

эндодезоксирибонуклеаза на одноцепочечной ДНК

Для работы фермента необходим Са²⁺

Применение: 1)отщепление нуклеотидов с концов двухцепочечной ДНК. Укороченные молекулы могут быть присоединены к синтетическим линкерам или векторам

2) Картирование сайтов рестрикции в ДНК. При обработке ДНК ферментом в разные моменты времени отбирают пробы. Реакцию останавливают добавлением этиленгликоль тетрауксусной кислоты (избирательное связывание Са²⁺). После обработки проб рестриктазами можно наблюдать исчезновение рестриктов в определенном порядке.

ЩЕЛОЧНАЯ ФОСФАТАЗА: катализирует отщепление 5'-фосфатных остатков одно- или двухцепочечной ДНК, РНК, рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.