- •Курсовая работа
- •Реферат
- •Содержание
- •Введение
- •1 Основная часть
- •Биоповреждения материалов и изделий и их вид
- •1.1.1 Виды бактериальных биоповреждений и их характеристика
- •1.1.2 Факторы, влияющие на биоповреждения объектов
- •Характеристика микроорганизмов-декструкторов
- •1.2.1 Хемолитотрофные микроорганизмы (тионовые, нитрифицирующие, железобактерии)
- •1.1.3 Механизмы бактериальных биоповреждений
- •1.2.2 Гетеротрофные бактерии (протеолитические, липолитические, гликолитические)
- •1.2.3 Метаногенные бактерии и их характеристика
- •1.3 Методы обнаружения бактерий и идентификации микроорганизмов
- •1.3.1 Методы обнаружения бактерий и определения их численности
- •1.3.2 Методы-выделения микроорганизмов-деструкторов
- •1.3.3 Методы определения активности микроорганизмов и продуктов их метаболизма
- •1.4 Способы защиты материалов и изделий от биоповреждений м/о
- •1.4.1 Использование защитных покрытий
- •1.4.2 Полимерные материалы с антимикробными свойствами
- •1.5 Методы оценки биостойкости материалов и защитных покрытий
- •1.5.1 Почвенный метод
- •1.5.2 Метод агаровых сеток
- •1.5.3 Метод агаровых блоков
- •1.5.4 Методы оценки адаптации бактерий к антимикробным веществам
- •2 Экспериментальная часть
- •2.1 Материалы и оборудование
- •2.2 Микроорганизмы и питательные среды
- •2.2.1Питательные среды для культивирования грибов
- •2.2.2 Выделение чистых культур бактерий
- •2.3 Методы анализа
- •2.3.1 Определение общего количества бактерий методом культивирования
- •2.3.2 Построение калибровочных зависимостей микроорганизмов по спектру мутности
- •2.3.3 Анализ физиологической активности бактерий редуктазным методом
- •2.3.4 Метод определения эффективных концентраций биоцидов
- •2.3.5 Оценка защитного действия биоцидных веществ методом «агаровой сетки» и «агаровых блоков»
- •2.3.6 Оценка защитного действия биоцидных веществ микрокалориметричеким методом
- •2.4 Результаты исследований и их обсуждение
- •2.4.1 Оценки биостойкости материалов по гост 9.048
- •2.4.2 Анализ биостойкости материалов по методу «агаровой сетки» и агаровых блоков
- •2.4.3 Характеристика биостойкости материалов микрокалориметрическим методом
- •Заключение
- •Используемая литература
2.2.2 Выделение чистых культур бактерий
Чистой культурой микроорганизмов называют культуру одного вида, выращенного как потомство одной клетки. Методы выделения чистых культур микроорганизмов основаны на изоляции одной микробной клетки от массы микроорганизмов и последующем выращивании потомства этой клетки на питательных средах изолированно от других видов.
Выделение чистых культур осуществляется в несколько стадий. Первая стадия – отбор и подготовка проб. На данной стадии может осуществляться количественный анализ содержания требуемых микроорганизмов в материале.
Второй стадией является получение элективной культуры. Необходимо отметить, что для достижения наилучших результатов при выделении микроорганизмов обычно добиваются при сочетании нескольких элективных факторов. К числу факторов относят физические (температуру, электромагнитные излучения, концентрация молекулярного кислорода, активность воды), химические (состав питательной среды, которую используют в качестве элективной, наличие в ней ингибиторов роста и биоцидов, а также реакцию среды) и биологические факторы (живые питательные среды, использование симбиотических партнеров).
Третья стадия – получение чистых культур микроорганизмов, в данном случае – бактерий. Чтобы из смешанной элективной культуры получить требуемый микроорганизм в виде чистой культуры, необходимо добиться разобщения клеток, после чего обеспечить условия, в которых образуется их потомство.
Существуют методы прямого выделения одной клетки при микроскопировании (их обычно применяют для относительно крупных микроорганизмов) и косвенные методы, основанные на плотных средах (с последующим формированием колоний) либо в жидких средах (с последующим формированием суспензий). Наиболее простым и чаще других используемым способом получения чистой культуры является чашечный метод Коха, который состоит в физическом разобщении клеток на плотной среде, в результате чего одна клетка формирует одну колонию, состоящую из генетически однородных особей – потомков единственной клетки.
Для разобщения клеток аэробных микроорганизмов используют следующие методы:
- посев методом Коха на поверхность плотной среды в одной чашке Петри. Для получения изолированных колоний элективную культуру следует развести. При этом бывает трудно предсказать относительное содержание в суспензии требуемых микроорганизмов, и поэтому обычно делают высевы из нескольких серийных разведений (чаще из разведений 10-4–10-6);
- посев методом Коха на плотные среды в трех чашках Петри. Этот способ обычно дает наилучшие результаты при высеве смешанных культур, то есть позволяет выявить наибольшее разнообразие морфологических типов колоний;
- посев истощающим штрихом. Данный метод выбирают в тех случаях, когда существует уверенность, что требуемый организм находится в элективной культуре в достаточно высокой концентрации.
Для получения изолированных колоний анаэробов выбирают:
- глубинный посев. Здесь требуется провести разведение элективной культуры. Обычно производят засев разведений 10-4–10-6;
- разведение суспензий в плотных питательных средах. Данный метод используют для облигатных анаэробов. Его суть состоит в том, что в пробирки для разведения элективной культуры вместо физиологического раствора вносят расплавленную агаризованную питательную среду, охлаждают ее до 45–46оС, после чего совершают все манипуляции по разведению суспензии. Делают 6–10 последовательных разведений с шагом 10. Затем среду с пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем стерильной смеси парафина и вазелинового масла (в соотношении 3:1) для защиты среды от проникновения воздуха.
Получение чистых культур прямым выделением клеток при микроскопировании. Методы данной категории требуют специального оборудования и не применимы для выделения очень мелких клеток и неклеточных существ:
- капельный метод Линднера позволяет выделять крупные клетки цианобактерий, дрожжей, мицелиальных грибов, водорослей, простейших. Разводят элективную культуру в стерильной питательной среде с тем расчетом, чтобы в небольшом объеме (0,01 мл) содержались одиночные клетки (обычно получают разведения
10-6–10-8). На поверхность нескольких стерильных покровных стекол бактериологической петлей наносят микрокапельки разведенной суспензии. Готовят препараты «висячая капля» и просматривают под микроскопом. Отбирают те препараты, в которых присутствует по одной клетке, и инкубируют их во влажных камерах 12–24 ч. Затем вновь микроскопируют и растущие культуры бактериологической петлей переносят в жидкие или плотные питательные среды.
- выделение клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор представляет собой устройство, которым оснащают микроскоп, позволяющее с помощью специальной микропипетки извлекать из суспензии одну клетку. Все действия осуществляются под микроскопом [19].