2.2.8. Лигирование.

Состав лигазной смеси показан в таблице 2.21.

Табл. 2.21 Состав лигазной смеси.

Название	Кратность, количество, активность в растворе
Буфер для Т4 ДНК-лигазы (Fermentas)	1X
ДНК	1000 ng
T4 ДНК-лигаза	10 U

2.2.9.Обратная полимеразная цепная реакция.

ПЦР проводили в амплификаторе «Amply 4» фирмы «Biokom».

Состав смеси ПЦР представлен в таблице 2.22.

Табл. 2.22 Состав смеси для обратной ПЦР

Название	Концентрация, активность, количество в растворе
Taq Buffer (+(NH4)2SO4,-MgCl2) («Fermentas»)	1X
dATP	0,2 mM
dCTP	0,2 mM
dGTP	0,2 mM
dTTP	0,2 mM
MgCl2	2,5 mM
Primer f	0,4µM
Primer r	0,4µM
ДНК	30 ng
Taq Polymerase	2,5 U

Для предотвращения испарения ПЦР-смеси поверх нее капали 30 мкл минерального масла.

Параметры ПЦР, использованной во время постановки ПЦР:

1. Д енатурация ДНК: Т=95^оС, 2 мин

2.1. Денатурация ДНК: Т=95^оС, 30 сек

2.2. Отжиг праймеров: Т (см. табл.), 1 мин 30 циклов

2.3. Синтез: Т=72^оС, 3 мин

3. Синтез: Т=72^оС, 5 мин

Праймеры для ПЦР подбирались с помощью программы VectorNTI 9 (табл. 2.23).

Табл. 2.23 Праймеры, использованные в обратной ПЦР

Название праймера		Последовательность 5’-3’	Температура отжига
297 _f	aatgatcattgtaataatcgcac		55
297 _r	ggcttcggcaaggtttatgt
Springer_f	gaaatctacagcccaactga		53
Springer_r	atattgtcggaatgactcgc
17,6_f	gaagacgttccattacccct		55
17,6_r	ggcacaattgctggttcttg
Opus_f	cgacaatgagacgataatggt		55
Opus_r	ttggctggttgcctactaag
Tirant_f	cgtcatccataccttcgcta		55
Tiranr_r	tggtggaactccaacaactg
Idefix_f	gtaagcaaaaagaacacacgc		55
Idefix_r	gtgcgccatcgtagtagttt
Zam_f	cttccaatcgtcgctccac		55
Zam_r	ctaacacggagcgagttgtt
Gypsy_f	agacgagcctctagggaga		55
Gypsy_r	cagctatcctcgctttcgta
Quasimodo_f	caagcacaacactagactac		54
Quasimodo_r	acgaagtccacacgtctcac
Transpac_f	ttgtcacgaagacatctcta		52
Transpac_r	ccacgtgcattggttaacgt
Rover_f	caagatgcaaatccaactgc		53
Rover_r	agggttactatcgcatcaac

2.2.10. Саузерн – блот гибридизация.

Перенос геля на нитроцеллюлозную мембрану.

Агарозный гель электрофорез (0,7 % гель №2 см. табл. 2.9) обрезали, оставляя тот участок, где находились пробы с ДНК, молекулярный маркер вырезали, проявляли в 0,05% растворе этидия бромида, фотографировали. Собирали конструкцию, изображенную на рисунке. Внизу конструкции находилась ванночка, заполненная 0,4 М NaOH. Далее располагалась подставка, на которую положили пропитанные NaOH листы  ватманской бумаги, таким образом, чтобы края были опущены в раствор NaOH, поверх бумаги положили агарозный гель, а сверху него – мембрану («Sigma Bio Bond Plus Nylon membrane»), имеющую такой же размер, как и гель. Поверх мембраны располагался кусок ватманской бумаги совпадающий по размеру с мембраной. Сверху всей это конструкции клали стопку бумажных полотенец, имеющих размер мембраны, поверх всего ставили стеклянную подставку с грузом.

Рис. Конструкция переноса ДНК из геля на нейлоновую мембрану.

Конструкцию оставляли на ночь. За счет капиллярных сил, ДНК из геля переносилась на мембрану.

Готовую мембрану ополаскивали в чашке Петри в 1 Х растворе SSC (см. табл. 2.24),на протяжении 5 мин, далее 5 минут фиксировали под ультрафиолетовой лампой.

Табл. 2.24 Состав 20X SSC.

Название	Концентрация в растворе
NaCl	3M
Sodium citrate (Na3C6H5O7)	0,3M

Синтез зонда.

Зонд синтезировали ПЦР - методом с геномной ДНК с специфическими праймерами. Состав ПЦР смеси указан в таблице, но в данной реакции ДНК брали около 1000 ng на реакцию.

Параметры ПЦР:

1. Д енатурация ДНК: Т=95^оС, 2 мин

2.1. Денатурация ДНК: Т=95^оС, 30 сек

2.2. Отжиг праймеров: Т (см. табл.), 1 мин 30 циклов

2.3. Синтез: Т=72^оС, 1 мин

3. Синтез: Т=72^оС, 3 мин

Праймеры для ПЦР подбирались с помощью программы VectorNTI 9 (табл. 2.25).

Табл. 2.25 Праймеры для синтеза зонда.

Название	Последовательность 5’-3’	Температура отжига	Размер продукта
Gypsy_f	ccaaccaacaatctgaaccc	55	651
Gypsy_r	cagctatcctcgctttcgta	55
17.6_f	cgcagtcgatgtgatcagt	55	585
17.6_r	ggcacaattgctggttcttg	55
Idefix_f	gcagtcggttaggatccaat	55	493
Idefix_r	gtgcgccatcgtagtagttt	55
Zam_f	tatgaacggcgaagcgtatg	55	350
Zam_r	ctaacacggagcgagttgtt	55
Rover_f	ttgttgtgcatccataccgt	53	292
Rover_r	agggttactatcgcatcaac	53
Springer_f	acaccactaccctgaatcat	53	656
Springer_r	atattgtcggaatgactcgc	53

Очистка зонда.

ПЦР продукт анализировали в агарозном гель - электрофорезе № 1 (см. табл.), вырезали подходящие по размеру полосы геля под UV- лампой. Собирали в пробирки объемом 1,5 мл. Выделяли ДНК набором «Fermentas».

1. Добавили 3 :1массе геля Binding Buffer.

2. Грели 5 минут при 55˚ С, каждую минуту инвентировали.

3. Добавить ресуспендированный Silica Powder Suspension.

≤2, 5 mg ДНК- 5 мкл

≥2,6 mg ДНК- 2 мкл на 1 mg ДНК

4. Инкубировать 5 минут при 55 ˚ С. Мешали каждую минуту, чтобы сохранить Silica Powder Suspension в состоянии суспензии.

5. Центрифугировали 5 секунд при 10 g, супернатант сливали.

6. Повторяли пункт 1-5.

7. Добавляли Wash Buffer.

Табл.2.26 Состав Wash Buffer.

Название	Объемная доля в растворе
Concentrated Washing Buffer	2,50%
96% этанол	50%

8. 1) Ресуспендировать осадок.

2) Центрифугировали 5 секунд при 10 g.

3) Удаляли супернатант.

Повторяли подпункт 1-3 три раза

9. Сушили осадок 10минут

10. Растворяли его в небольшом количестве воды Nuclease Free Water в зависимости от величины осадка (10-40 мкл).

11. Концентрацию ДНК измеряли с помощью спектрофотометра (модель «Nanodrop» фирма Thermo Fisher Scientific).

Мечение зонда.

Метили зонд, гибридизовали мембрану с зондом, отмывали блот от излишков зонда с помощью набора «Amersham Gene Images AlkPhos Direct Labelling and Detection System».

1. ДНК доводили до концентрации 10 нг/ мкл, концентрация соли в ней должна быть не более 50 мМ, брали 10 мкл.

2. Денатурировали ДНК - кипятить в течение 5 мин, затем резко переносили в лед.

3. Добавляли Reaction buffer (10 мкл), аккуратно перемешать. Реакция проходит на льду.

4. Добавляли реагент маркировки Labeling reagent (10 мкл) , перемешивали аккуратно на льду.

5. Добавляли соединительного агента рабочего Cross-linker (2 мкл), центрифугировали при 10 g. Рабочий Cross-linker :20 мкл стокового Cross-linker и 8 мкл воды Nuclease Free Water.

6. Инкубировали 30 минут при 37 ˚ С. Зонд использовали либо сразу, либо в течение 2-х часов, при условии хранения его на льду.

Гибридизация мембраны с зондом.

1. Мембрану прогревали в чашке Петри в гибридизационном буфере (см. табл.2.28) 15 минут при 55 ˚С. Каждые 3 минуты помешивали чашку.

Табл. 2.28 Состав рабочего гибридизационного буфера.

Название	Концентрация в растворе
NaCl	0,5 М
Blocking reagent	4% (w/v)
Hybridization buffer

2. Добавляли меченый зонд (5-10 нг на мл буфера), аккуратно смешивая с гибридизационным буфером и мембраной.

3. Инкубировали на протяжении ночи при 55 ˚С.

Отмывка блота.

1. Инкубировали Wash buffer 1 (см. табл.2.29) в чашке Петри на протяжении 10 минут при 55 ˚С.

Табл. 2.29 Состав Wash buffer 1.

Название	Концентрация в растворе
Urea	2 M
SDS	0,1% (w/v)
0.5 M Na phosphate pH 7.0	50 mM
NaCl	150 mM
1.0M MgCl2	1 mM
Blocking reagent	0.2% (w/v)

2. Переносили блот в Wash buffer 1 и промывали на протяжении 10 минут при 55 ˚С. Повторяли процедуру в новом согретом Wash buffer 1.

3. Переносили блот в Wash buffer 2 (см. табл.2.30) и инкубировали при комнатной температуре 5 минут. Повторяли процедуру в новом Wash buffer2.

Табл. 2.30 Состав Wash buffer 2.

Название	Концентрация, кратность в растворе
Secondary wash buffer	1Х
1 M MgCl2	2 mM

Табл. 2.31 Состав 20Х Secondary wash buffer.

Название	Концентрация в растворе
Tris base	1 M
NaCl	2 M

4. Использовали в течение 30 минут.

Обработка блота проявляющим реагентом.

Обработку проводили реактивом «Amersham Gene Images CDP-Star Detection»

Добавили Detection reagent 30-40 мкл/ см². Инкубировали на протяжении 5 минут при комнатной температуре.

Детекция блота с помощью рентгеновской пленки.

В темноте поверх мембраны с зондом помещали рентгеновскую пленку и инкубировали на протяжении часа. Затем, помещали пленку в раствор-проявитель (см. табл. 2.32.) до появления на пленке четких полос (около 40 секунд). Ополаскивали водой и окунали пленку в раствор - фиксаж (см. табл. 2.33) на минуту, потом снова ополаскивали водой.

Табл. 2.32 Состав раствора - проявителя.

Название	Концентрация в растворе
Метол	2,2 g/l
Na2SO3 (б/в)	72 g/l
Гидрохинон	8,8 g/l
Сода (б/в)	48 g/l
KBr	4 g/l
H2O

Табл. 2.33 Состав раствора – фиксажа.

Na2S2O3× 5 H2O	260 g/l
NH4Cl	50 g/l
Na2S4O8	17 g/l
H2O

2.2.12. Постановка эксперимента.

Отбирали 250 виргинных самок и самцов 3-х линий. Помещали отдельно самцов, отдельно самок в пробирки (высота - 20см., диаметр – 2см.) по 5 штук в каждую. Пересадка на свежий корм осуществлялась раз в неделю.

2.2.13. Сбор данных.

Подсчет умерших мух осуществляли ежедневно, кроме воскресенья.

14. Статистическая обработка данных

Расчеты велись в программе SPSS13 и Microsoft Exel.

Для характеристики выборок использовали описательную статистику.

Для проверки нормальности распределения использовался критерий Колмогорова-Смирнова.

Для оценки достоверности различий выборок по линиям и по полу использовался непараметрический критерий Манна-Уитни.