Inc и далее буква латинского алфавита, и цифра. Для агробакретий дали название Rh-1 и 2. В ризобиях агробактериальные плазмиды поддерживаются нормально. В эту группу входят и ризобиальные плазмиды.
Эктопиновые и нопалиновые плазмиды - Rh-1
Агропиновые - Rh-2
A.Rhizogenes плазмиды - Rh-3
Для соотнесения ДНК с определенными функциями использовался сначала рестрикционный анализ и гибридизация по Саузерна. Это большие плазмиды, с которыми сложнее работать, чем с колийными. В 1980 году применили другой подход к плазмиде рTiС58. Депикер клонировал Hind3 фрагменты в pBR322, затем их резали мелкощепящими рестриктазами, это оказалось более успешным.
По такой же схеме проанализировали pTiAch 5 (октопиновая). Эти первые изученные плазмиды - сходны по сайтам рестрикции и в целом по длине фрагментов. В течение 5 лет с 1981 проанализировали разные плазмиды, появилось представление (общее) о плазмидах. Обнаружили A, B, C и D области гомологии. Расположение их в плазмидной ДНК оказалось не одинаковым. Следовательно эволюция исходной плазмиды шла по нескольким путям и возможные генетические перестройки былии связаны с перемещением областей гомологии. Показали, что и в Ri плазмидах есть гомологичные Ti участки, и далее в плазмидах Rhizobium обнаруживали сходные с агробактериальными плазмиды (Sim - симбиотические плазмиды ризобий). В основной эти общие участки соответствовали области гомологии D. Это позволяло предполагать, что функции связанные с контактом бактерий и растений должны локализоваться в этой области. Чтобы соотнести каждый конкретный фрагмент на рестрикционной карте с теми или иными функциями, применялись разные подходы. В первую очередь - делеции фрагментов из pBr 322, а их анализировать на детерминацию каких-либо свойств в агробактериях. Но этот путь оказался не совсем удачный. Более удачен - способ с применением транспозонов. Имелись неплохо отработаные варианты введения транспозонов в плазмидный геном. В этом случае не только нарушалась функция гена, но и маркировался мутантный локус антибиотикорезистентностью. Основные работы сделаны с транспозонами Tn 7, 5, 9. 7 - стрептомицин, 5 - каномицин, 9 - хлорамфеникол. Для получения инсерционных мутантов использовали плазмиды широкого круга хозяев из Inc P и W. Это связано с тем, что в 1978 году бельгийцы показали, что pRp4 из Inc P хорошо воспринимается агробактериальными клетками и при скрещивании этих бактерий с E.coli, передавались и коинтеграты (не только pRp4) Rp4 и Ti. Используя штамм E.coli с Tn7 в качестве реципиента, были получены первые инсерционные мутанты. Такие коли дальше скрещивались с агробактериями, отбор на стрептомицине. В агробактериальных клетках коинтеграт распадался и можно было отобрать варианты, где Ti плазмида со вставкой. Анализировались свойства этих бактерий вызывать опухоли.
Еще один вариант получения транспозоновых мутантов, pJB4J1 - плазмида самоубийца. Tn-5 и фрагмент фага Mu (дестабилизирует наследование репликона). Плохо реплицируется везде, кроме коли. Вводят эту плазмиду в агробактерии и после коньюгации высевать на среду с Km. Транспозон может конечно перейти в хромосому, но может и в плазмиду. Если при элиминации резистентность терялась, то встраивание произошло в плазмиду. Таким путем в лаборатории Шелла получили Tn5 индуцированные мутанты некоторых Ti плазмид.
Пришли к выводу, что в составе плазмид:
Гены за индукцию опухолей
За синтез опинов опухолевыми клетками
За утилизацию опинов в качестве источников углерода и энергии
Мутанты чувствительные к агроцину К 84 (производится A.radiobacter) (использовали для отбора)
Гены, ответственные за чувствительность к фагу Ар1
За коньюгацию (tra оперон)
Анализирую мутантов с измененными онкогенными свойствами, пришли к выводу, что во всех плазмидах есть участок, соответствующий Т-ДНК. Он соотносится с областью гомологии А. Поначалу все мутанты, где транспозоны были встроены в эту область - Onc- мутанты. Но потом выяснили, что утрата онкогенности может происходить при встраивании в область гомологии В и D (в ней - гены вирулентности). Тогда разграничили мутанты, не способные вызвать опухоли - Onc- и Vir- (не способны внедрять свою ДНК, невирулентны).
Vir область.
8 оперонов в этой области. В октопиновых и нопалиновых эти опероны не одинаковы. Обозначают vir A-H. В нопалиновых Vir f и H, но есть белок Tzs. Данные были получены на плазмидах 15-955 и С58. Все гены в вир области - регулон. Часть оперонов имеют еще и свою регуляцию. Vir A, G - двухкомпонентная регуляторная система. Подобные системы известны у разных бактерий. Считают, что эти 2 белка обеспечивают запуск всего комплекса генов и реагируют они на присутствие веществ, выделяющихся при разрушении растительных клеток (ацетосенгон, конифениловый спирт, феноловая и горчичная кислоты. Все это фенолы растительного происхождения, появляющиеся на этапе синтеза лигнина или суберина). Помимо этих веществ, через эту же сенсорную систему влияют D-галактуроновая и глюкуроновая кислоты (компоненты пектиновых веществ), а также обычные сахара (глюкоза, арабиноза, галактоза). И, наконец, есть реакция системы на рН в кислую сторону.
Сенсорный белок - VirA. Состоит из нескольких доменов. 2 трансмембранных домена. Между ними - периплазматический домен, цитоплазматический домен больше по размерам. Этот домен делится функционально на несколько участков (связующий - линкер, киназный и домен, закрывающий в отсутствие индуктора киназный домен). Обладает аутофосфорилирующей активностью по гистидину. Если появляются индукторы, то фосфатная гурппа переносится с гистидина в VirA на аспартат в белке Vir G. В результате чего последний активируется и может инициировать транскрипцию. Передача сигнала нужна для активации всего регулона за счет взаимодействия VirG с промоторами практически всех генов области.
В оперонах есть Vir боксы. Последовательности из 12 пар нуклеотидов, с которыми связвается VirG в фосфорилированном состоянии. РНК полимераза взаимодействует после связвания VirG с боксом и начинается транскрипция. Для максимально активации оперона необходима мультимеризация или димеризация VirG. Этот белок определяет и свою экспрессию и экспрессию VirA. И первыми при воздействии появляются именно они, чтобы дать максимальный ответ. Количество VirG возрастает при фосфатном голодании и при некоторых воздействиях, так как VirG имеет еще второй промотор.
Лекция 4
2-компонентная сенсорная система. Vir A -тансмембранный сенсорный белок, Vir G - активатор транскрипции. Активация происходит при связывании определенных Vir боксов на промоторах. Для оптимальной активации должен быть фосфорилирован. Фосфорилирование происходит белков Vir A при определенных условиях. Присутствие в раневом соке мономерных углеводов запускает работу Vir регулона, необходим также белок Chv, который кодируется на хромосоме. Он в значительной мере гомологичен белкам энтеробактерий (рибозо- и галактозосвязывающим белкам E. coli). Периплизматический домен Vir А гомологичен белкам системы хемотаксиса E.coli, в частности одному белку из транспорта глюкозы. Комплекс из углевода раневого сока с соответствующим белком так меняет конформацию Vir A, что он способен взаимодействовать с Vir G.
В раневом соке также присутствуют фенольные соединения, которые проявляют защитные свойства. Агробактерии могут реагировать на фенолы через ту же самую 2-компонентную систему. з-й фактор, воспринимаемый через эту систему - pH. Считается, что раневой сок имеет кислую реакцию (ниже 5.5), а при таких занчениях усиливается экспрессия Vir G. Было показано, что усиливается транскрипция со второго промотора, на котором нет Vir боксов (нет регуляции продуктом). Может быть кислая среда является превичным фактором, активирующим Vir систему.
У разных агробактериальных штаммов (на разных Ti плазмидах) Vir G и Vir A несколько различаются. Было показано, что сам белок Vir A также реагирует на изменение pH несколько по-разному. Для каждого из них есть свой уровень pH, при котором он лучше всего воспринимает соответствующие стимулы.
Помимо Chv хромосомных генов вирулентности есть ген Mia A, кодирующий изопентилтрансферазу, который влияет на индукцию vir-оперона. Ген Ros оказывает негативное влияние на индукцию VirC и VirD оперонов.
Считается что в целом самый первый этап индукции vir-оперонов зависит от хромосомных генов. Они не дают высокого уровня экспрессии.
Необходимо чтобы агробактериальные клетки закрепились на поверхности растения. В прикреплении играет роль экзополисахарид beta-1-2-глюкан, выделяемый бактериями. Витронектин - лектиноподобный белок, также играющий роль в пркреплении агробактерии. Негативный герулятор - чем его больше, тем меньше способность клеток прикрепляться. Att белок (3 белка было описано) необходим для прикрепления к мембране растительной клетке после того как бактерии закрепились в целлюлозном матриксе клеточной стенки.
Cel - белок влияет на индукцию синтеза целлюлозы в месте прикрепления (сейчас называется аtt ген)
Ach B - мутации в этом гене приводили к снижению уровня трансформации инфицированных клеток в опухолевые. Предполагается участие в формировании канала, через который передается T-ДНК в клетку.