Тестирование днк

Извлечение ДНК и Амплификация полного генома

ДНК тестирование сухих пятен крови проводился на образцах с повышенным КK. Высушенные пятна крови были направлены в клиническую лаборатории секвенирования ДНК в университете штата Юта. Геномная ДНК очищена с помощью MasterPure (Мэдисон, Висконсин, каталог номер MC89010).Часть (2mm2) каждой карты пятен крови была погружена в 300 мкл раствора для клеточного лизиса, содержащего 50 мкг протеиназы К, и инкубирована при 50 ° С в течение 16 часов; 160мкл MasterPure ™ реагента осаждения белков было добавлено к образцам, и затем их поместили на лед на 30 минут. Лишние вещества удалены центрифугированием в течение 10 минут при 10000 в микроцентрифуге .Супернатант был перелит в новую пробирку, содержащую 600μl изопропанола, и оставлен при температуре -20 ° С в течение 30 минут. ДНК осаждали центрифугированием при 4 ° С в течение 10 минут при 10000 , промыванием в 70% ледяном этиловом спирте, высушиванием на воздухе и ресуспендировали в 20 мкл ТЕ буфера, рН 7,6. Амплификация полного генома (WGA) этой очищенной ДНК из каждой капли крови проводилось с Repli-г комплектом (Qiagen, Валенсия, штат Калифорния, каталог номер 150045). Пять мкл геномной ДНК денатурировали в течение 3 минут при комнатной температуре и нейтрализуют в соответствии инструкцией завода-изготовителя, 50 мкл окончательной смеси, содержащей Repli-г ДНК-полимеразу инкубировали при 30 ° C в течение 16 часов с последующим нагреванием при 65 ° C в течение 3 минут для инактивации фермента.

Анализ мутаций

Удаление и анализ последовательности гена дистрофина были выполнены на матрице ДНК WGA с использованием 2-х ступенчатого SCAIP метода, как это описано прежде. Этот метод использует полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и флуоресцентное секвенирования ДНК для выявления делеций и точечных мутаций в 79 экзонах и около 50 последовательностях интронов из основных изоформ транскрипта мРНК плюс 5 'нетранслируемой области (УТР), 3' УТР и 6 альтернативных промоутеров. ПЦР проводили в 10 мкл с использованием платиновой Taq ДНК-полимеразы (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Ферментативную очистку проводили ExoSAP-IT реагентом (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния), а также рассматривали образцы секвенирования с использованием ABI (Applied Biosystems, Foster City, CA) BigDye Terminator v.3.1. Образцы проанализированы с использованием программного обеспечения, описанного ранее.32 нуклеотидные позиции были определены в соответствии с эталоном последовательности, который используется для анализа мутаций (инвентарный номер GenBank NM_004006.2).

Все образцы были проанализированы на делеции / дупликации одного или множественных экзонов в гене дистрофина с использованием усиленного зонда (Salsa [ММПУ] Комплекта P034/P035 DMD / Becker ММПУ; MRC-Голландия, Амстердам, Нидерланды). Один микролитр WGA шаблона в 5 мкл ТЕ буфера был нагрет при 98 ° C в течение 5 минут, и охлажден и разделены в 2 отдельные пробирки; 1.5мкл Salsa P034 и P035 праймеров добавляли в пробирки, соответственно, и инкубировали при 95 ° С в течение 1 минуты с последующим отжигом при температуре 60 ° С в течение 20 часов. ДНК-лигазы добавляли к каждой реакции в общем объеме 20 мкл и инкубировали при 54 ° C в течение 15 минут, после 5-минутной инкубации при 98 ° C. Пять мкл впоследствии было использовано в ПЦР, которая состояла из 35 циклов: 95 ° C в течение 30 минут, 60 ° С в течение 30 минут и 72 ° С в течение 1 минуты, после чего проведена окончательная инкубации при 72 ° С в течение 20 минут ; 1.5мкл образца помещены в ABI 3730xl и проанализированы размеры фрагмента с помощью GeneMapper программного обеспечения (Applied Biosystems). Диагностическая точность анализа сухой капли крови по шаблону WGA подтверждена анализом пятен крови, пациентов с МДД и родителей с известными мутациями, в том числе делецией 7 экзона и дупликацией 6 экзона. Анализ показал 100% точность на этих образцах.

Анализ мутаций был проведен у 9 анонимных образцов от 2 женщин и 7 мужчин, которые имели уровень КФК> 2000 и не имели мутаций, выявленных в гене МДД. 7 самых общих генов, которые вызывают конечностно-поясную мышечную дистрофию (КПМД) были отобраны, как приоритетные для анализа (DYSF, CAPN3, SGCA, SGCB, SGCG, SGCD и FKRP). DYSF и CAPN3 секвенировали с 15мкл шаблонов с помощью WGA SCAIP метода. Эти тесты для точечных мутаций в гене DYSF (ссылка мРНК, Национальный центр биотехнологической информации [NCBI] NM_003494.3, 55 экзонов кодирования 237kDa белка дисферлина) и в CAPN3 гене ( мРНК, NCBI NM_000070.2 24 экзонов кодирования кальпаина-3 изоформы белка 94kDa). В образцах, где не обнаружено DYSF или CAPN3 мутаций, проводился анализ следующих генов: SGCA (NM_000023.2), SGCB (NM_000232.4), SGCD (NM_000337.5), SGCG (NM_000231.2) и FKRP (NM_024301.4).

Результаты

Скрининг новорожденных на уровень КK : Фаза 2 и Фаза 3

Фазы 2 пилотного исследования скрининга 6928новорожденных была проведена в крупных больницах в Колумбусе и Цинциннати, штат Огайо. На этом этапе исследования, мы отслеживали количество тех, кто отказался согласия и нашли , что 6,0% (п = 478) лиц дали одобрение. Мы обнаружили, что у 110 человек КK ≥ 600U / л и превысила порог, требующий анализа ДНК. Только у 2 больных КК ≥ 2000 Ед / л (2461 и 2675) было установлено наличие мутаций в гене дистрофина. .Ложно-положительные результаты на этом этапе составили 1,6% (108 из 6926).

Пилотное исследование дало толчок для изменения порога КK для штата, 3 фазы программы ≥ 750U / л. Данные, полученные от обследования дополнительных 10 937 новорожденных мальчиков привели к выявлению 58 человек с повышенным уровнем КФК. У одного новорожденного была найдена мутация в гене дистрофина, и его КK> 2000 Ед / л (2003 ед / л).Ложноположительных результатов на этапе 3 было 0,52% (57 из 10 936). Увеличение порога КK с 600U / л до 750U / л сократило число новорожденных, которым требуется анализ ДНК на 68%.

Дополнительных интерес представляет КK тестирования в период новорожденности, так как считается , что уровень этого фермента повышен от травмы при прохождении новорожденного через родовые пути. Мы изучили это, проверяя КФК в последующих образцах венозной крови, полученных у лечащего врача для участников на этапе 2 и 3 фазы исследования. Нам удалось получить образцы только 43 из 165 пациентов, которые были отрицательны на наличие мутаций гена МДД и у которых КК был определен на сухой капле крови (распределились следующим образом: 35 между 600 и 999U / л, 6 от 1000 до 1499 МЕ / л и 2 от 1500 до 1999 МЕ / л). В большинстве случаев последующей анализ уровня КК в венозной крови был ниже по сравнению с сухой каплей крови (рис. 2). Особо следует отметить, самая высокая группа 1700 Ед / л при повторе показала уровни КФК в 46U / л. Только в 2 случаях, КK остается умеренно высокой> 500U / л (888 уменьшение до 672, 809 уменьшение до 656). Это подтверждает, что высота КK в сухой капле крови может быть связана с травмой при рождении и составляют большинство значений выше нормы, результаты которых похожи на предыдущий доклад. Примечательно то, что у 1 младенца с документально подтвержденной мутацией гена дистрофина, у которого определялась КК в сухой капле крови, КK была 2462 ед / л, и при повторных анализах венозной крови в течение 6 недель обнаруживалось резкое повышение до 8888 Ед / л.