Какие требования предъявляются к приборам для э/ф?
субмарины для горизонтального э\ф
гель полимеризуется просто путем помещения расплавленного на горизонтальную поверхность, ничем не закрытую сверху. Потом в буфер. Иногда гель формируется прямо в камере.
Если используются буферы с небольшой буферной емкостью => большие камеры. Иначе, при длительном эксперименте, б.е. может не хватить (особенно если это ТАЕ)
Для радикального решения проблемы – насосы и система средств рециркуляции буфера – отводы из катодной и анодной камер с помощью перистальтического насоса. Решение проблемы ограниченой буферной емкости засчет того, что система все время перемешивается.
Буфер после товарища надо перемешать, чтобы сравнять рН
еще лучше – сменить полярность (если оба электрода делаются из метало., которые не корродируют)
иногда нужен термостат – например, для агарозного геля в небольших концентрациях нужна пониженная температура.
Для формирования зон нанесения используются аппликаторы. объем пробы – 60-80% от объема зоны, которую сделали аппликатором. Чем тоньше – тем лучше, т.к. тогда лучше разрешение.
Вертикальные
Для ПААГ как правило
такие системы должны обладать герметичностью. Иначе О2 помешает полимеризации. проблема контроля за Т.
Иногда процесс должен идти при повышенных Т, причем выше Т разогрева геля – снова контроль.
«рубашка», в ней циркулирует жидкость, которая задает Т. Теплоноситель, к которому подключен термостат. Может быть как охлаждение, таки нагрев.
проблема – контакт с гелем; внизу – ванночка, естественный контакт, проблем нет. Сверху – вырез, «кроличьи уши» - дают естественный контакт с буфером, налитым в верхниюю ванночку.
В более простых системах, теплораспределитель – буфер из одной из ванн; Т не контролируем, но следим за равномерным ее распределением.
Если не следим – эффект улыбки. Центр нагревается сильнее, большая подвижность. Почему?
Еще вариант – металлическая пластина, алюминий или дюраль, приклеена к стеклу и способствует равномерному распределению тепла.
Источник тока – стабилизация напряжения – единственный нужный параметр, желательно контролировать, чтобы спокойно уйти, и знать что гель не разогреется и закипит.
Нужно ограничить сверху ток или мощность, что если бы эти параметры превысили некий верхний предел, напряжение бы снижалось.
Для агарозного геля диапазон напряженности – до 10 В\см, нарма 5-7.
Длина геля около 10 см.
Значит, 100 достаточно, хотя на самом деле больше, т.к. надо учитывать размер камеры.
Проводимость геля не сильно меньше проводимости буфера, надо учитывать длину между электродами
ПААГ – допускается 100 В\см; 2-3 КВ норма → надо работать аккуратно, 2КВ это абзац. Должны быть средства защиты оператора!
Можно создавать колодцы с мощью аппликаторов в ПААГ
Аппликаторы в ПААГ могут сделать артефакты! Т.к. поле получаются неоднородным. И формироваться могут плохо, если гель слишком долго полимеризовался – из зоны перегородок все мономеры диффундируют.
Для ПААГ проводимость сильно зависит от наличия геля. Напряженность искажена
И вместо нормальной зоны мы можем получить искаженные зоны в виде полумесяцев.
Стандартные гребенки плохо – «улыбки-полумесяцы»
Еще больше усугубляют искажение ионогенные компоненты
Чтобы избежать этого – гребенка «акульи зубы»
Сначала формируется гель с ровной поверхностью, потом прижимается гребенка, чтобы от него уже сформировались перегородки, т.к. он диэлектрик – проблем с неоднородностью электрического поля не возникает. Вносится проба. Один край стекла д.б. существенно меньше, чем длина. Нужна твердая рука и хорошее зрение
Когда проба войдет в гель, аппликатор можно убрать
Элюция БП из геля
Пассивная элюция (диффузия):
с разрушением геля
без разрушения геля
Гели с низкой температурой плавления –
нагревание до 40-50º, гель разрушается.
буфер для элюции, выравнивается концентрация, механически отделим гель
Хороша для ПААГ. Добавить значительное количество буфера и надеяться, что диффузией концентрации БП в геле и буфере выровняется. А потом отделить ц/ф.
чем больше времени, тем полнее элюция
полнота экстракции и концентрации БП определяется объемом
смотря что нужно, точность или количество БП
Растворение геля:
спец. сшивающие агенты для ПААГ
LMT agarose (экстракция фенолом, гидролиз агаразой)
растворение агарозы в хаотропных агентах (NaI, NaClO4, соли гуанидина)
или агараза – гидролизует до нитей
потом можно использовать гель-фильтрацию, отделитьпродукты гидролиза от высокомолекулярной ДНК
если агароза не легкоплавкая – хаотропные агенты. Агароза необратимо переходит в жидкое сотояние
Агенты нужно убрать – сорбция на стекле, например.
ПААГ – сложнее. Мы можем выделить при условии, что нам нужен ни сам БП, а, скажем, определить долю радиоактивной метки.
Электроэлюция (на примере ячейки ISCO)
Если нам нужна хорошая экстракция, и при этом в небольшом объеме.
почти то же электрическое поле
Система из 2-х камер. В одну камеру – гель, в другую – то, что будет концентрировать БП.
Для НК или крупных белков– диализная мембрана, в которой регулярные поры определенного размера, и крупные молекулы не проходят. При этом в системе может протекать электрический ток, небольшие электролиты легко проходят сквозь мембрану. БП достигает мембраны и дальше не может двигаться. Электролит аккуратно убрать, и извлечь небольшой объем с БП. Хотя БП скорее всего сорбируется на мембране. Далее ресорбция
Для небольших БП, которые могут легко пройти через мембрану:
Для олигов – диэтиламминоэтилцеллюлоза, ионообменный сорбент, с высокой плотностью положительного заряда. Необратимо сорбирует анионы в условиях небольшой ионной силы.
А десорбцию можно провести, увеличив ионную силу.
Или вообще любой анионный обменник
Если нам надо сохранить картину пространственного распределения БП – используются методы переноса целого геля на мембрану.
Исторически первы метод – блот-гибридизация по Саузерну
Метод придумать по спартански
Нитроцеллюлозная мембрана – к которой можно присоединить коваленто ДНК. Удобно для последующей радиографии. Причем ДНК потом сама присоединится, в процессе дегидратации.
ДНК можно передается по почте в бумажке(раствор нанесли, высушили)
Можно присоедить ковалентно к бумажке – и использовать прямо с бумажки.
Присоединение происходит засчет ОН-групп целлюлозы. А на нитроцеллюлозе еще эффетивней.
Система из подручных материалов
Гель, к нему плотно прилежит слой нитроцеллюлозы, над ней – несколько слоев бумажных полотенец, которые и обеспечат ламинарный поток, который перенесет БП.
Материал подшивался в журнал.
Легко переносит небольшие молекулы, с большими эффективность ниже.
Небольшая модификация – вместо бумажных полотенец небольшой вакуум.
Электроперенос
Более эффективен
Прибор почти не отличаются
На электродах образуются газы, которые формируют неоднородности – используют электроды, которые сорбируют газы
Водород хорошо растворяется в пористом углероде и в металлах типа платины и палладия.
Непрерывная элюция –
Тогда бы гель по удобству сравнялся с хроматографией.
Полный анализ смеси и отдельных компонентов в отдельных объемах
Гель в трубке
По мере выхода, малые объемы буфера, содержащие разные зон, которые только что из геля вышли, забираются и БП элюируется
Использование подушки электролитов в высокой концентрации, чтобы произошел скачок напряженности → вышедший БП на границе концентрируются. А с границы ламинарным потоком удаляем.
Система сложная
Организовать ламинарный поток сложно
Более простая система – цилиндрический гель
Цилиндрический гель, по центру тонкая трубка, через которую собственно проводится элюция, гель заканчивается пористым материалом, в котором создается похожий неламинарный поток, в направлении, противоположном действию электрического поля, если он интенсивный, если скорость пассивного движения выше, чем при движении в электрическом поле – все, что из геля вышло, попадает в трубку, а затем в коллектор.
Может быть система непрерывной детекции, спектрофотометр. Получаем спектр
Развитие приборов.
«Чипы», а на самом деле тонкий канал, сотни нм
В свободной среде или псевдо геле
Камеры одноразовые
Принципы аналогичные, просто формат современный.
«за этой картиной стоит грустная история»