3.5.4._Дополнительные тесты идентификации

При наличии санитарно-эпидемического неблагополучия следует использовать дополнительные тесты. Прежде всего еще раз уточнить реакцию плазмокоагуляции, с этой целью культуру пересевают 2-3 раза на скошенной МПА и повторяют постановку реакции, или рассевают культуру на чашках с мясо-пептонным агаром для проведения повторной идентификации на новых колоний стафилококков. В случае неудовлетворительных результатов целесообразно из первичных посевов взять ряд других колоний и подвергнуть их вновь идентификации.

Если выделенную культуру не идентифицировали как St.aureus, следует использовать дополнительные тесты: постановку реакции на термостабильную ДНКазу, окисление маннита, фосфатазу, лецитовителлазу.

Тест на лецитовителлазу

При использовании для первичного посева среды, содержащей желток, специального дополнительного определения лецитовителлазной активности у стафилококков проводить не следует. В случае выделения культур с других сред и необходимости определения у них этого признака на чашку с желточным агаром сеют испытуемую культуру штрихом или бляшкой - последнее экономнее. Чашки инкубируют при 37°С в течение 18-20 часов. Ори положительном результате вокруг колонии стафилококка образуется радужный венчик, что обусловлено выделением фермента лецитовителлазы и разложением лецитина, находящегося в среде. Реакцию следует учитывать в отраженном свете.

Реакция на разложение маннита в анаэробных условиях

Используют среду, приготовленную из сухого препарата с индикатором ВР и маннитом, разливают в пробирки по 10 мл, стерилизуют при 0,7 атм 20 минут. Перед посевом среду освобождают от воздуха, для чего пробирки кипятят в водяной бане при 100°С 10 минут, затем быстро охлаждают в ледяной воде и немедленно производят посев уколом. Сверху засеянную среду заливают расплавленным 2% водным агаром слоем 2-3 см, чтобы исключить попадание воздуха. Посевы термостатируют при 37°С в течение 4 дней. Просмотр осуществляют на 2 и 4 дни. Результаты расценивают как ферментацию маннита, когда нижняя и верхняя части среды чётко изменяют цвет из зеленого на синий. В этом случае микроорганизмы идентифицируют как St.aureus. Если посинеет только верхняя часть среды, то имеет место окисление маннита. Если спустя 4 дня инкубации не произошло посинения, сбраживания маннита не произошло. В 2-х последних случаях микроорганизмы относят к St.epidermidis или St.saprophyticus.

Определение активности кислой фосфатазы

Среда: к 100 мл 2% МПА, расплавленного и остуженного до 45°C, добавляют 50 мг паранитрофенилфосфата натрия, разливают в чашки Петри. Посев производят бляшками - до 20 бляшек на чашку. Реакцию можно учитывать уже через 2 часа инкубации при 37°С. Вокруг бляшек при положительной фосфатазной пробе среда окрашивается в желтый цвет. Интенсивность окрашивания увеличивается через 18-24 часа - практически окрашивается вся среда.

Тест на наличие термостабильной дезоксирибонуклеазы (ДНКазы)

ДНКаза определяется по методу, основанному на метахроматических свойствах толуидина голубого. Этот метод диффузии в агар термостабильной ДНКазы St.aureus позволяет определить ее в концентрации примерно 0,005 мг/мл.

Среда: к 1000 мл 0,05 М трис-буфера (оксиметиданинометан), рН 9,0, добавляют 0,3 г ДНК, затем 10,0 г агара Дифко, I мл 0,01 М CaCI₂, 10,0 г NaCI, 3,0 мл 0,1 М толуидина голубого. Среду разливают в пробирки по 12-15 мл, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике до 3-5 месяцев. Перед постановкой реакции среду растапливают и разливают в чашки Петри, подсушивают при 4°С в течение I часа, вырезают лунки диаметром 3 мм, отсасывают пипеткой агар и вносят в лунки пастеровской пипеткой культуры, инкубируют при 37°С.

Перед изучением культур пробирки с суточным ростом стафилококков на полужидком агаре прогревают в кипящей водяной бане 15 минут и вносят в лунки в агаровой пластинке, содержащей толундин голубой. Зоны просветления с розовым окрашиванием образуются в результате гидролиза ДНК, находящейся в среде, термостабильной ДНКазой стафилококков. Появление через 1-2 часа после внесения розовоокрашенных зон расценивается как положительная реакция на наличие термостабильной ДНКазы.