Заняття №6 Живильні середовища для культур клітин

1. Загальна характеристика середовищ для вирощування культур клітин.

2. Характеристика складових частин поживних середовищ.

Загальна характеристика середовищ для вирощування культур клітин

Середовища на яких, ростуть і розмножуються культури тваринних клітин постачають їм необхідні поживні речовини, забезпечують певний рівень кисню, кислотність та інші показники. Перелік компонентів середовищ та їх призначення наведено на рис.6.1.

Поживне середовище для культур клітин
Підготована вода	Суміш неорганічних солей	Окремі компоненти у певних кількостях (амінокислоти, вітаміни)		Сироватка Крові	Інші речовини природного походження (гормони, ліпіди)
Синтетичне середовище
Напівсинтетичне середовище
Середовища з мінімальною кількістю компонентів
Підтримуюче середовище			Ростове середовище
Короткочасна підтримка клітин, забезпечити розмноження не можуть			За властивостями наближаються до до тканинної рідини, що оточує клітини в макроорганізмі. Забезпечують довготривале розмноження клітин.

Рис. 6.1. Призначення і компонентний склад середовищ для культур клітин.

Середовища готуються на основі хімічних реактивів з максимальним ступенем очищення. Певний відсоток домішок може знаходитись не тільки в неорганічних солях, в цукрах, але й в біологічних компонентах середовищ (амінокислоти, вітаміни, гормони тощо). Неорганічні компоненти поживних середовищ є досить стабільними. Виключенням є кристалогідрати (сульфати магнію, фосфати натрію), які здатні поглинати вологу з атмосфери.

Органічні кислоти (аскорбінову, глютамінову) краще зберігати в сухому вигляді, тому що в розчинах вони швидко руйнуються. Певні вітаміни, гормони та фактори росту зберігають у замороженому вигляді.

Таким чином, поживні середовища для росту і розвитку культур клітин:

• повинні бути стерильним,

• не містити токсичних для клітин речовин;

• мати кислотність на рівні 6,9-7,4 (оптимальне рН=7,2). Зміни рН в кислу чи лужну сторону повинні контролюватись буферними речовинами, присутніми в складі середовища (карбонати, фосфати, органічні кислоти та їх солі та ін.).

Характеристика складових частин поживних середовищ

Підготовка води. Якість води та її стандартність дуже важливі при роботі sз середовищами будь-якого типу. Для культур клітин потрібно використовувати щойно підготовлену воду (рис. 6.2).

Варіанти підготовки води для роботи з культурами клітин
Варіант №1		Варіант №2
В ода водопроводу		В ода водопроводу
Д истилят		У льтрафільтрація
Бідистилят		Іонний обмін або дистиляція
Іонообмінні смоли		Збереження при 80 оС

Рис.6.2. Варіанти підготовки води для культур клітин.

Підготовану в запас воду можна зберігати впродовж певного часу. При тривалому збереженні води в ній здатні накопичуватись іони металів, молекули скла, пластмаси, тобто – матеріали тари. Вуглекислий газ з повітря накопичується у воді в разі використання незакритих бутилів.

Сольові розчини. Неорганічні солі використовують для виготовлення сольових розчинів, які імітують іонний склад сироватки крові (розчин Хенксу, розчин Ерла). Вміст іонів в цих розчинах наближений до їх фізіологічних концентрацій в рідинах макроорганізму, а сумарна концентрація – забезпечує необхідний осмотичний тиск та кислотність (табл..6.1.).

Табл.6.1. Склад сольових розчинів для вирощування культур клітин.

Компоненти, г/л	Вид розчину
	Розчин Ерла	Розчин Хенкса
Глюкоза	1,0	1,0
Феноловий червоний	0,02	0,02
NaCl	6,8	8,0
KCl	0,4	0,4
CaCl2	0,2	0,14
MgSO4*7H2O	0,2	0,2
NaH2PO4*2H2O	0,14	-
Na2HPO4*H2O	-	0,06
KH2PO4	-	0,06
NaHCO3	2,2	0,35

Розчин Ерла містить набагато більше бікарбонату натрію, ніж розчин Хенксу, і тому має властивості сильного буферу. Перед фільтруванням крізь розчин Ерлу пропускають вуглекислий газ, а крізь розчин Хенксу – повітря. Остання обставина є недоліком, характерним для розчину Ерла. Крім того, для певних видів клітин бікарбонат є токсичною речовиною. Тому зараз при роботі з первинними та вторинними культурами найчастіше користуються розчином Хенкса. Розчином Ерла користуються, коли працюють із культурами, для яких характерна висока концентрація клітин та значна швидкість їх росту.

Білкові та небілкові компоненти. Існує мінімальний набір компонентів, який дозволяє вирощувати культури клітин. Саме такий набір компонентів знаходиться в мінімальному середовищі Ігла (МЕМ), яке містить 13 амінокислот, 8 вітамінів, глюкозу та 6 неорганічних солей. Крім середовища Ігла, на практиці традиційно широко використовують середовища 199, ДМЕМ та інші.

Більшість дослідників використовує мінімальні середовища, додаючи до них природні інгредієнти. Ними є:

• сироватка крові великої рогатої худоби (в тому числі , і телят , і ембріонів корів), свиней, коней. Даний продукт містить приблизно 1000 різних речовин; пептидних факторів росту і гормонів. Недоліками сироватки є варіабельність складу, контамінація супутньою мікрофлорою, наявність антитіл. Для інактивації останніх сироватку прогрівають (30 хв. при температурі 56^оС).

• гідролізат лактоальбуміну (отримують при гідролізі білків молока);

• гемогідролізат – продукт ферментативного гідролізу згустків крові ВРХ або людини, які є відходами при виробництві γ–глобуліну;

• ферментативний гідролізат м’язової тканини ВРХ.

Сучасний напрямок розробки нових середовищ для культур клітин передбачає заміну сироватки іншими – більш дешевими і менш дефіцитними компонентами. В середовища без сироватки додають альбумін, фібронектин, інсулін, глюкагон, гідрокортизон, прогестерон та інші гормони, ліпіди, молозиво тощо.

Антибіотики. Дані речовини захищають культури від забруднення клітинними мікроорганізмами. При масовому культивуванні тваринних клітин найчастіше використовують антибіотики, рекомендовані концентрації яких наведено в таблиці 6.2. Від використання антибіотиків під час культивування тваринних клітин неможливо відмовитись, хоча їх додавання до середовищ супроводжується певними труднощами:

• деякі антибіотики в розчинах нестабільні (пеніцилін втрачає 50% активності в першу добу).

• практично всі антибіотики у вищезазначених концентраціях діють на супутні мікроби не цидно, а статично. Тому при тривалому культивуванні доводиться іноді припиняти додавання антибіотиків. Такий метод дозволяє перевірити наявність чи відсутність супутніх мікроорганізмів в культурі.

• збільшення концентрації різних антибіотиків та їх ефективна дія проти мікробів може призвести до загибелі культури (ефективні концентрації антибіотика токсичні для тваринних клітин).

Таблиця 6.2. Антибіотики для культур клітин.

Діє на мікроорганізми	Назва антибіотика	Концентрація антибіотика, мкг/мл середовища
Грампозитивні прокаріоти	Пеніцилін	100
Грамнегативні прокаріоти	Стрептоміцин	50-100
Грамнегативні та грам-позитивні прокаріоти	Полі міксин	50
Мікоплазми	Тилозин	10
Мікоплазми і грам-негативні прокаріоти	Гентаміцин Канаміцин	50-100 50-100
Гриби і дріжджі	Нистатін Амфотерицин В	25-50 25

Таким чином, вибір антибіотику впливає і на тривалість розвитку стерильної культури клітин, і на саму можливість розмноження клітин в живильному середовищі.

ЗАВДАННЯ:

1. Охарактеризуйте складові частини мінімальних, сироваткових та безсироваткових середовищ для культур клітин.

2. Методи стерилізації середовищ для вирощування культур клітин.

3. Обладнання для поживних середовищ, в яких вирощують тваринні клітини.