25. Синтез ведущей и отстающей цепей днк.

Инициация. Подготовка ДНК матрицы. Точки начала репликации на молекуле ДНК – ori-сайт - имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А-Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки DnaA). Далее геликаза осуществляет денатурацию ДНК, а топоизомеразы снимают напряжение еще не раскрученной ДНК. SSb-белки с свою очередь препятствуют обратной ренатурации ДНК.

Элонгация. Синтез ДНК цепей. Репликационная вилка разделяется на отстающую цепь и лидирующую. Т.к ДНК-полимераза может работать только направлении 5'3', то на лидирующей цепи синтез идет непрерывно. Отстающая цепь образуется в виде фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза III доходит до РНК-затравки предыдущего фрагмента Оказаки и отделяется. Ей на смену приходит ДНК-полимераза I, которая осуществляет последовательное отщепление нуклеотидов с 5’-конца РНК-затравки предшествующего фрагмента.

Терминация. Окончание синтеза. ДНК-лигаза соединяет фрагменты Оказаки, а гираза закручивает цепочки ДНК в спираль. РНК-полимераза I (прокариот), (РНКазаН у эукариот) - удаляет РНК-праймеры. Теломераза достраивает теломерные участки хромосом эукариот.

25. Сравните процесс репликации у прокариот и эукариот.

- у эукариот репликация идет в S-период митотического цикла в ядре и ДНК содержащих органоидах.

- ДНК полимеразы различны

- молекула ДНК у эукариот – полирепликон. У прокариот – монорепликон.

- скорость репликации у эукариот 50нукл. в сек. у прокариот – 500нукл. в сек.

- длина фрагментов Оказаки у эукариот – 100-200пар нукл., у прокариот – 1000-2000 пар нуклеотидов.

- у эукариот присутствует проблема недореплицированности. Наличие теломер решает проблему недореплицированности концов линейных молекул. (у прокариот кольцевая молекула)

26. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Условия проведения ПЦР. Этапы процесса.

ПЦР – молекулярный генетический метод получения in vitro большого количества копий определенного фрагмента ДНК.

Условия проведения ПЦР:

- R-праймаза. ДНК-праймер. 1мкл

- L-праймаза. ДНК-праймер. 1мкл

- dNTP (дезоксирибонуклеотидтрифосфат) – 5мкл

- буферный раствор 10 мкл

- дистиллированная вода 22 мкл

- ДНК-матрица 10мкл

- Taq – полимераза 1мкл

Итого: 50 мкл

Смесь помещают в амплификатор на 1.5-2 часа.

Этапы процесса:

1 этап: Денатурация ДНК. Протекает при 93-94°С в течение 30-40 сек. Происходит разрушение водородных связей.

2 этап: Присоединение праймеров (отжиг). Присоединение праймеров происходит комплементарно к соответствующим последовательностям на противоположных цепях ДНК на границах соответствующего участка. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 50-65 градусов. Время отжига 20-60 сек.

3 эпап: Достраивание цепи (элонгация). Комплементарное достраивание цепей происходит от 5’-конца к 3’-концу в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей служат добавляемые в раствор нуклеотиды. Синтез происходит при температуре 70-72 С, время синтеза – 20-40 сек. Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами для нового цикла амплификации, в котором происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК (ампликона). В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом, происходит накопление ампликонов в растворе по формуле 2n, где n- число циклов амплификации. Поэтому, даже если в исходном растворе первоначально находилась всего одна двухцепочечная молекула ДНК, то за 30-40 циклов в растворе накапливается около 10⁸ молекул ампликона. Этого количества достаточно для достоверной визуальной детекции этого фрагмента методом электрофореза в агарозном геле. Процесс амплификации проводится в специальном программируемом термостате (амплификаторе), который по заданной программе осуществляет смену температур согласно числу циклов амплификации.

27. Составьте схему амплификации фрагмента ДНК с помощью ПЦР.

28. Детекция результатов ПЦР.

После амплификации ДНК-фрагмента с помощью ПЦР, фрагмент гидролизуют подходящей рестриктазой. Фрагменты разделяют гель –электрофорезом, а интересующий фрагмент выделяют с помощью специфичного генного зонда.

Генный зонд – это молекулы ДНК или РНК, меченные радиоактивными изотопами.

29. Области применения ПЦР.

Клиническая лабораторная диагностика

• диагностика вирусных инфекций (ВИЧ, гепатит, половые инфекции и др.)

• определение  отцовства

• диагностика генных болезней (выявление мутаций)

• судебная медицина (напр. идентификация личности)

Фундаментальная наука и практика

• секвенирование (определение нуклеотидной последовательности, меченые атомы)

• клонирование генов

• генная инженерия (создание трансгенных животных и растений)

• генная терапия

• направленный мутагенез

30. Изменчивость как свойство живых организмов. Классификация изменчивости. Биологическое значение изменчивости.

Изменчивость - разнообразие признаков среди представителей данного вида, также свойство потомков отличаться от родительских форм.

Классификация изменчивости:

1. Модификационная или фенотипическая изменчивость. Охватывает изменения признаков, которые происходят под влиянием условий развития или факторов внешней среды. Является ненаследственной.

Характеризуется следующими особенностями:

- развитие в сходных условиях носит групповой характер проявления признака.

- изменчивость носит обратимый характер.

- влияние среды может изменить проявления признаков на основе наследственного проявления нормы реакции. Норма реакции – свойство данного генотипа обеспечивать в определенных пределах развитие данного онтогенеза в зависимости от меняющихся условий внешней среды.

2. Комбинативная изменчивость. Изменчивость, которая возникает вследствие рекомбинации генов во время слияния гамет. Является наследственной.

- независимое расхождение хромосом во время мейоза;

- случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения;

- рекомбинация генов вследствие кроссинговера.

3. Мутационная изменчивость. Изменчивость, вызванная действием на организм мутагенов, вследствие чего возникают мутации (реорганизация репродуктивных структур клетки). Мутагены бывают физические (радиационное излучение), химические (гербициды) и биологические (вирусы).

Фенотипическая изменчивость является главным фактором приспособления организмов к изменяющимся условиям внешней среды.

Наследственная изменчивость поставляет материал для эволюционного процесса.

31. Комбинативная изменчивость. Механизмы возникновения. Рекон.

Комбинативная изменчивость – изменчивость, которая возникает вследствие рекомбинации генов во время слияния гамет. Является наследственной.

Механизмы возникновения:

- независимое расхождение хромосом во время мейоза;

- случайная встреча половых гамет, а вследствие этого и сочетания хромосом во время оплодотворения;

- рекомбинация генов вследствие кроссинговера.

Рекон - элементарная единица генетической рекомбинации, или минимальное расстояние между двумя точками хромосомы, в пределах которых возможна рекомбинация. Термин введён в 1957 американским генетиком С. Бензером.

32. Мутации. Мутон. Классификация мутаций.

Мутация - изменение генотипа, происходящее под влиянием внешней или внутренней среды. Термин предложен Гуго де Фризом. Процесс возникновения мутаций получил название мутагенеза.

Мутон – наименьший участок ДНК, изменение которого приводит к мутации.

Классификация мутаций:

В зависимости от размера поврежденного участка ДНК выделяют генные, хромосомные и геномные мутации. По локализации в клетке – соматические и генеративные (наследственные мутации, которые переходят в сегрегационный груз). Полезные мутации, вредные или нейтральные (оценивает естественный отбор).

Мутации также делятся на спонтанные и индуцированные. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно на протяжении всей жизни организма в нормальных для него условиях окружающей среды с частотой около 10⁻⁹ — 10^{− 12} на нуклеотид за клеточную генерацию.

Индуцированными мутациями называют наследуемые изменения генома, возникающие в результате тех или иных мутагенных воздействий в искусственных (экспериментальных) условиях или при неблагоприятных воздействиях окружающей среды.