Тема 6. Фитопатогенные микроорганизмы

Занятие 10. Знакомство с некоторыми микроорганизмами- возбудителями болезней растений

План

Микроскопическое исследование:

1. фитопатогенных бактерий, вызывающих мокрую гниль клубней картофеля - Bact. xanthochlorum schuster;

2. фитопатогенных грибов: картофельного грибка - Phytophtora infestans, снежной плесени озимых посевов - Fusarium nivale, черной хлеб­ной плесени — Rhizopus nigricans, плесени, поражающей овощи и фрукты, грибков из рода Sclerotinia.

Материалы и оборудование

1. Культуры исследуемых бактерий и грибов.

2. Фуксин.

3. Микроскоп.

4. Предметные и покровные стекла.

5. Иммерсионное масло.

6. Иглы и петли для пересева.

7. Препаровальные иглы.

8. Стеклянные палочки.

9. Газовая горелка или спиртовка.

10. Штативы для предметных стекол.

11. Лотки.

Основные сведения

Существует очень много микроорганизмов, вызывающих различные заболевания растений. Значительная часть болезней растений имеет бакте­риальное или вирусное происхождение; основная же масса болезней вызы­вается различными патогенными грибами.

Бактерия, вызывающая мокрую гниль Bact. xanthochlorum schuster, легко проникает через поврежденные покровные ткани в клубень картофе­ля. Бактерии разлагают межклеточное вещество, протоплазму клеток, раз­рушают ткани, что в конце концов приводит к гибели клубня. Бактерии хорошо размножаются на картофеле во влажных, плохо проветриваемых овощехранилищах. Меры предохранения от заражения состоят в том, что­бы хранить картофель в сухом прохладном помещении.

Плесневые грибы. Тело гриба - мицелий - состоит из тонких нитей, или гиф, переплетенных между собой. У низших грибов мицелий несег- ментированный - не имеет поперечных перегородок, а у высших грибов гифы имеют перегородки и расчленены на клетки. При бесполом размно­жении у грибов образуются спорангии, содержащие споры (споры эндо­генного происхождения) или же конидии (споры экзогенного происхожде­ния).

Конидии отрываются и разносятся ветром, а спорангиоспоры обра­зуются внутри спорангия и освобождаются при разрушении его стенки.

При классификации фитопатогенных грибов и определении их вида большое внимание уделяется строению мицелия и органов размножения.

Грибы - бесхлорофилльные микроорганизмы, живут на поверхности различных субстратов. Клетки грибов имеют дифференцированное ядро, поэтому их относят к эвкариотам. Плесневые грибы не требовательны к питательным средам, но большинство из них нуждается в кислороде воз­духа. Они легко переносят низкие температуры, могут жить и размножать­ся в холодильных камерах. Среди грибов встречаются как сапрофиты, так и паразиты. Все грибы делятся на высшие и низшие и относятся к шести классам.

Хитридиевые (Chytridiomycetes), оомицеты (Oomycetes), зигомицеты (Zygomycetes) относят к низшим грибам; аскомицеты (Ascomycetes), бази- диомицеты (Basidiomycetes) и дейтеромицеты, или несовершенные грибы (Deuteromycetes, Fungi imperfecti), - к высшим.

Грибы не имеют хлорофилла, поэтому они используют для своего питания углерод только из готовых органических соединений, то есть они являются гетеротрофами. Все грибы, кроме примитивных низших и неко­торых высших (дрожжей), имеют вегетативное тело - мицелий, или гриб­ницу,- состоящее из тонких ветвящихся гиф. Мицелий может быть погру­женным (субстратный), развивающимся внутри среды и поверхностным (воздушный), развивающимся на поверхности среды. У низших грибов он одноклеточный. Септы (перегородки) перфорированы, что обеспечивает сообщение между клетками и таким образом создает замкнутую систему, состоящую из гиф (трубочек), заполненных цитоплазмой и множеством ядер. Иногда мицелий грибов образует ризоиды - корешкообразные вы­росты, при помощи которых крепится к субстрату и получает питательные вещества.

Склероции - сплетение гиф округлой или продолговатой формы. Они имеют большие размеры, уплотнены, устойчивы к неблагоприятным воздействиям среды, содержат мало воды и много питательных веществ. У некоторых высших грибов склероции представляют почкующуюся стадию мицелия.

Многие грибы образуют хламидоспоры - разросты мицелия с утол­щенной оболочкой, внутри которых содержатся питательные вещества. Они могут быть одно- и многоклеточными и служат для сохранения вида, так как хорошо переносят неблагоприятные условия среды.

От мицелия отходят плодоносящие тела - спорангиеносцы у муко- ровых и конидиеносцы у монилиевых. Спорангиеносцы заканчиваются расширением - спорангием с эндоспорами. При разрыве спорангия эндос­поры освобождаются и, попадая в благоприятные условия, дают начало новой плесени. На конидиеносцах образуются конидии, или экзоспоры. Они имеют разную форму: шаровидную, булавовидную, продолговатую и т. д. Конидии могут быть одиночные, когда образуются по одной на каж­дом ответвлении конидиеносца, и множественными, если образуется не­сколько конидий. Конидиеносцы бывают простые (неразветвленные) и разветвленные. Разветвленные имеют на конце ветвления - верхушечные клетки бутыловидной или веретеновидной формы, называемые фиалидами у пеницилла. У аспергилла такие клетки имеют форму шипов и называют­ся стеригмами. Они располагаются на расширении конидиеносца и бывают одно- и двухъярусные. Нижняя клетка стеригм несет несколько клеток вто­рого яруса.

Рост на сусло-агаре. Мукор (Mucor mucedo) - представитель класса зигомицетов - растет в виде пушистого серого налета. Рост появляется в течение первых суток. Аспергилл (леечная плесень) - представитель клас­са дейтеромицетов. Растет медленнее. Рост появляется на вторые сутки.

Конидии могут быть черного цвета (Aspergillus niiger), желто-зеленого (Asp. fumigatus), желтого (Asp. flavus) и зеленовато-желтого (Asp. oryzae). Пеницилл (кистевик) - представитель класса дейтеромицетов, образует на среде нежный налет в виде пушка серо-зеленого цвета или ярко-зеленого с белым ободком по периферии. Хорошо выраженные кисточки появляются на вторые-третьи сутки.

Ход работы

Бактерии, вызывающие мокрую гниль картофеля. Препаровальной иглой снимают небольшое количество слизистого налета с клубня карто­феля, пораженного мокрой гнилью Bact. xanthochlorum schuster, размеши­вают его на предметном стекле в капле воды. Мазок фиксируют, окраши­вают фуксином и рассматривают с иммерсионным объективом. В поле зрения микроскопа видны бактерии, имеющие форму небольших палочек. Рассматриваемые микробы зарисовывают.

Ф итопатогенные грибы. Приготовление препаратов. Плесневые грибы рассматривают в препарате «раздавленная капля», для чего материал препаровальными иглами распределяют на предметном стекле в капле изотонического раствора хлорида натрия или стерильной воде.

Препарат мукора готовят из односуточной культуры, аспергилла и пеницилла - из двухсуточных. В культуре мукора и аспергилла лучше брать серые головки, пеницилла - на границе серого и зеленого по пери­ферии колонии. У аспергилла с серыми, но не с черными конидиями бы­вают хорошо видны стеригмы в виде лепестков подсолнечника. Мукор рассматривают под малым увеличением (объектив 8), аспергилл - расши­рение конидиеносца - вначале находят под малым увеличением, затем бо­лее детально рассматривают под средним. Пеницилл изучают под средним увеличением (объектив 40). Необходимо помнить, что плесневые грибы размножаются спорами. Поэтому препарат надо готовить вблизи предмет­ного стекла, не допуская рассевания спор.

Препаровальные иглы по окончании работ тщательно стерилизуют над пламенем горелки.

Фузариум (несовершенные грибы).

Мицелий белый, розовый или желтый. От него отходят короткие ветвящиеся конидиеносцы, на концах которых располагаются конидии. Они могут быть серповидными с несколькими перегородками (макроконидии) и овальными (микроконидии), чаще без перегородок.

Хламидоспоры бывают шаровидными,

грушевидными, располагаются скоплениями или цепочкой. Образуются в старых конидиенос- цах, строме, конидиях. Воздушный мицелий хорошо развит (рис. 26).

Фузариумы широко распространены в природе.

Многие из них вызывают порчу плодов, овощей, поражают всхо­ды растений. У пораженных растений листья пожелтевшие, на их поверх­ности - серовато-розовый налет. Фузариумы, особенно при низких темпе­ратурах, образуют токсины (зеараленон, Т-2 микотоксин и другие). При поедании животными и птицей пораженных растений и зерна наступает их отравление. Клинически это проявляется в угнетении, нарушении коорди­нации движений и других признаках. Микотоксин зеараленон вызывает у свиней эстрогенизм, дегенеративные изменения яичников, матки, что при­водит к бесплодию. Т-2 микотоксин поражает желудочно-кишечный тракт, сердечно-сосудистую, нервную системы, а также костный мозг, лимфати­ческие узлы и другие органы и ткани.

Дрожжи. Это безмицелиальные одноклеточные почкующиеся грибы, относятся к классу аскомицетов. Форма клеток разная, но чаще овальная, округлая, лимоноподобная.

К летки дрожжей имеют оболочку, цитоплазму и, в отличие от про­кариот, оформленное ядро, которое хорошо видно в неокрашенном препа­рате. Цитоплазма молодых клеток более однородна, с возрастом появля­ются вакуоли. Дрожжи крупнее бактериальных клеток, их диаметр колеб­лется от 10 до 15 мкм. Внутри клеток дрожжей образуются споры, после чего они становятся сумками (асками). Число спор - от 4 до 12. Различают еще артроспоры, или покоящиеся клетки дрожжей. Они отличаются от ве­гетативных форм наличием двухконтурной оболочки, большим количест­вом запасных питательных веществ (гликогена, жира) и отсутствием ва­куолей. Размножение дрожжей происходит почкованием, спорами и поло­вым путем (копуляцией). На поверхности материнской клетки после отде­ления почки остается дочерний шрам, который состоит из хитина и пред­ставляет округлое выпячивание с приподнятым ободком по периферии (рис. 11).

Приготовление препаратов. Каплю культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которую готовят заранее, наносят петлей на предметное стекло. Накрывают покровным стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Клетки дрожжей видны и при мень­шем увеличении (х400), но для сравнения их размеров с другими микроор­ганизмами препарат лучше рассматривать под иммерсионной системой.

Микроскопическая картина: в поле зрения микроскопа видны округ­лые и вытянутые клетки, среди которых встречаются и почкующиеся.

Картофельный гриб фитофтора (Phytophtora infestans) поражает ли­стья, стебли и клубни картофеля (рис. 27). Споры его прорастают и обра­зуют мицелий, который проникает внутрь тканей, преимущественно по межклетникам, и вызывает их отмирание, ткани при этом приобретают бу­рую окраску. Через устьица на поверхность листьев выходят воздушные гифы в виде белого пушка. На концах воздушных нитей формируются ко­нидии, напоминающие по форме плоды лимона с сосковидными бугорка­ми на концах. Конидии отпадают целиком. В сырую погоду при темпера­туре ниже 18°С в конидии образуются подвижные зооспоры, которые передвигаются во влажной среде с помощью двух жгутиков. При температуре выше 18°С конидии прорастают гифой, которая проникает в здоровые ткани листа или других органов картофеля, вызывая заражение этой культуры.

П репаровальной иглой снимают неболь­шое количество пушистого налета с поражен­ной фитофторой ткани (лучше клубня карто­феля), размешивают его на предметном стекле в капле воды, накрывают покровным стеклом и рассматривают при большом увеличении микроскопа (метод раздавленной капли).

Плесневый гриб ризопус (Rhizopus nigricans) - низший гриб, относится к семей­ству мукоровых. Мицелий ветвистый, некле­точный: плодоносящие гифы заканчиваются черными шарообразными спорангиями с эн­доспорами (рис. 28). Спорангии после созре­вания лопаются, и споры рассыпаются. Споры прорастают особыми выростами - ризоидами, прикрепляются к субстрату. Проросший гриб быстро распространяется по поверхности суб­страта во все стороны с помощью гиф, столонов или ризоморфов. Поражает семена зерновых культур, участвует в разрушении и порче различных плодов, овощей, хлеба и других продуктов.

Препаровальной иглой отбирают небольшое количество мицелия гриба. Готовят препарат методом раздавленной капли, рассматривают под микроскопом и зарисовывают.

Склеротиния (Sclerotinia) пора­жает овощи и фрукты, образуя на них пушистый белый налет. Спора прорастает гифой, которая проникает в ткани и разрушает клетки, вызывая их гниение. Мицелий многоклеточный, споры образуются экзогенно на конидиеносцах, которые отрываются целиком. Склеротиния на овощах и фруктах образует подушечки сероватого цвета (конидиальные спороношения).

Для изучения гриба берут покрытые белым пушком плесени яблоко или морковь и иголкой снимают немного налета. Готовят препарат методом раздавленной капли и рассматривают под микроскопом. Так же, как и при рассмотрении других препаратов, диафрагма микроскопа должна быть немного прикрыта, при этом неокрашенный препарат виден лучше. Препарат зарисовывают.

Лучистый грибок (Actinomyces griseus) имеет хорошо выраженный, очень тонкий ветвящийся несептированный мицелий. Мицелий проникает в субстрат, образуя плотную пластинку, вследствие чего его трудно отде­лить. На поверхности субстрата образуется воздушный мицелий, который может быть пушистым или мучнистым. На гифах мицелия образуются спорангиеносцы - спиральные или прямые, одиночные или собранные в метелки. Тип спорангиеносца - хороший систематический признак для ак- тиномицетов. Актиномицеты широко распространены в природе (почве, воде, иле), среди них встречается много видов патогенных, вызывающих актиномикоз - заболевание животных и человека. Они поселяются на се­менах злаков, дают споры, которые, попадая в организм человека, вызы­вают заболевание.

Есть виды, образующие антибиотические вещества. Так, Actinomyces griseus синтезирует стрептомицин - антибиотик, широко используемый в медицине.

Из чистой культуры Actinomyces griseus готовят препарат методом раздавленной капли. Накрывают его покровным стеклом и рассматривают под микроскопом при большом увеличении.

Для получения препарата культуру Actinomyces griseus надо брать вместе с кусочками питательной среды, так как отделить культуру от суб­страта очень трудно. Препарат зарисовывают.

Для работы можно использовать и другие виды актиномицетов: Actinomyces albus, A. bovis, A. citreus, A. chromogenes, A. longisporus, кото­рые различаются по цвету колоний и форме спорангиеносцев.

Контрольные вопросы

1. Как происходит заражение картофеля фитофторой?

2. Какие заболевания могут вызывать некоторые виды гриба фузари- ум? Какое строение имеют конидии этого гриба?

3. Какова роль ризоморф у гриба ризопус?

4. Какое практическое значение имеют некоторые виды актиномице­тов?