6.2. Выбор индуктора

Структурные гены, закодированные на продуцирование многих ферментов, в отсутствие субстратов этих ферментов являются обычно неактивными, т.е., иначе говоря, образование ферментов подавлено. Однако, когда в систему введен соответствующий субстрат, структурные гены включаются в работу, и происходит образование ферментов (рис. 6.1). Такой процесс называют индукцией [5].

Типичными индукторами являются такие субстраты, как крахмал и декстрин (для амилазы), сахароза (для инвертазы) и мочевина (для уреазы).

Рис. 6.1. Дифференциальный график индукции фермента при введении индуктора

Рис. 6.2. Сравнение потенции субстрата в отношении индукции амидазы при добавлении N-метилацетамида (1) и ацетамида (2)

Часто наиболее сильные индукторы являются аналогами субстратов, которые выступают малоактивными или вообще неактивными субстратами ферментов (рис. 6.2, табл. 6.1).

Индукция ферментов иногда происходит при добавлении в среду выращивания коферментов.

Для устранения зависимости образования ферментов от добавления индуктора могут применяться мутации, именуемые «регуляционными», т.к. в их основе лежат не структурные, а регуляторные гены [5].

Таблица 6.1

Аналоги субстратов – активные индукторы ферментов

Фермент	Субстрат	Аналог-индуктор
β-галактозидаза Пенициллин β-лактамаза Малеат цис-трансизомераза Алифатическая амидаза Тирозиназа Целлюлаза	Лактоза Бензилпенициллин Малеиновая кислота Ацетамид L-тирозин Целлюлоза	Изопропил-β-D-тиогалактозид Метициллин Малоновая кислота N-метилацетамид D-тирозин, D-фенилаланин Софороза

Мутанты, которые в обычных условиях продуцируют ферменты без индукторов, называют конститутивными. Они могут быть получены различными методами. Один из таких методов состоит в выращивании микроорганизмов в хемостате с лимитирующей концентрацией субстратного индуктора. Другой метод селекции заключается в нанесении популяции мутагенизированных источников углерода на субстрат, который не служит индуктором. В этих условиях могут расти только конститутивные мутанты.

Таблица 6.2

Продукты – индукторы ферментов

Фермент	Микроoрганизм	Субстрат	Продукт- индуктор
Глюкоамилаза Амилаза Декстраназа Пуллуланаза Липаза Эндополигалактуроназа Экзодополигалактуроназа Пектинэстераза Триптофаноксигеназа Гистидаза Мочевинкарбоксилаза	Aspergillus niger Bacillus stearothermophilus Penicillium Klebsiella aerogenes Geotrichum candidum Acrocylindrium Pseudomonas Klebsiella aerogenes Saccharomyces cerevisiae	Крахмал Крахмал Декстран Пуллулан Липиды Полигалакту-роновые кислоты Триптофан Гистидин Мочевина	Мальтоза; изомальтоза Мальтодекстрины Изомальтоза Мальтоза Жирные кислоты Галактуроновая кислота Кинуренин Уроканиковая кислота Аллофановая кислота

Определенные ферменты, указанные в табл. 6.2, продуцируются во время роста клеток, но их образование подавляется в тех случаях, когда конечные продукты обмена концентрируются в культуральной жидкости или когда они дополнительно вводятся в среду выращивания [5]. Такие низкомолекулярные продукты обмена (корепрессоры) взаимодействуют с внутриклеточным белком (апорепрессором), закодированным регуляционными генами, с образованием репрессора. Затем репрессор выключает из работы структурные гены, кодирующие ферменты. Такие ферменты называются подавляемыми.

Отдельные ферменты подавляются ближайшими или отдаленными продуктами жизнедеятельности микроорганизмов.

Устранение указанных соединений из среды выращивания в ряде случаев значительно увеличивает выходы ферментов. Так, при выращивании микроорганизмов лимит по аммиаку в среде подавляет многие ферменты, которые катаболизируют азотистые соединения. К таким ферментам относят протеазы, уреазы, рибонуклеазы, аргиназы и аллантоиназы.

Подавление биосинтетических ферментов конечными продуктами обмена более часто происходит, чем не происходит. Посредством ограничения внутренней аккумуляции конечных репрессоров можно добиться существенного увеличения продуцирования ферментов.

Одним из путей к ограничению внутреннего накопления конечных продуктов является добавление соответствующего ингибитора. Добавление к бактериальной культуре 2-тиазолаланина может более чем в 30 раз увеличить накопление десяти ферментов биосинтеза гистидина. Другой путь снижения накопления конечных продуктов заключается в ограничении подвода ростовых факторов питания к ауксотрофному мутанту. При этом частичное голодание приводит к интенсивному продуцированию ферментов, как это показано в табл. 6.3.

Таблица 6.3

Перечень питательных веществ, влияющих на биосинтез ферментных препаратов

Питательное вещество, в котором имеется аукстрофная потребность	Снимается подавление фермента	Увеличение синтеза фермента
Гистидин Лейцин Тиамин Биотин Гуанин	10 ферментов биосинтеза гистидина Оксиуксуснокислая синтетаза 4 фермента биосинтеза тиамина 7-оксо-8-амино-пеларгонатамидотрансфераза Инозинмонофосфатдегидрогеназа	В 25 раз В 40 раз До 1500 раз В 400 раз В 45 раз

Другим средством снятия подавления биосинтеза ферментов может служить выращивание частичных или так называемых «leaky» ауксотрофов (соединений, способных к медленному росту в среде и стимулирующихся собственными факторами роста) в условиях отсутствия конечных стимуляторов.

Можно получить и так называемые регуляционные мутанты, которые не подавляются конечными продуктами биосинтеза. Подобно мутантам, не требующим наличия индуктора, они тоже являются конститутивными и могут быть мутированы в гене-операторе так, что связывания репрессора происходить не будет.