11. Осаждение ферментов
11.1. Факторы, влияющие на осаждение ферментов
Подавляющее большинство промышленно важных ферментов являются водорастворимыми белками. Растворы ферментов неоднородны и содержат, помимо ферментов, большое количество растворимых в воде соединений и веществ коллоидной природы. Выделение ферментов из этой сложной смеси представляет определенные трудности, так как система весьма чувствительна к внешним воздействиям.
В промышленности используют осаждение ферментов солями и органическими растворителями. Эти способы различаются по механизму осаждения.
Эффект осаждения белков связан с тем, что присутствие гидрофильного органического растворителя снижает активность воды. Молекулы воды, расположенные на гидрофобных участках поверхности белка, замещаются на молекулы органического растворителя. При этом растворимость белков падает, происходит их агрегирование под действием электростатических и ван-дер-ваальсовых сил, возникающих между отдельными белковыми молекулами, и затем – осаждение.
Размер молекулы белка. Чем больше молекула фермента, тем ниже критическая концентрация растворителя, при которой происходит осаждение (рис.11.1). Как правило, крупные молекулы осаждаются быстрее, чем мелкие, так как в этом случае выше вероятность того, что на их поверхности находится заряженный участок, комплементарный другому белку.
Концентрация и природа растворителя. Органический растворитель, используемый для осаждения, должен смешиваться с водой и не связываться с ферментом. Наиболее широко для осаждения ферментов используют ацетон, этиловый и изопропиловый спирты, реже – кетоны, эфиры и их смеси. С учетом возможной токсичности, взрывоопасности и перспективы регенерации, для
Рис. 11.1. Агрегирование белков в водном растворе с органическим растворителем
Рис.
11.2. Осаждение
амилолитических ферментов из экстракта
культуры A.
oryzae
органическими растворителями: 1
– изопропанол; 2
– ацетон; 3
– диоксан; 4
– этанол
производства наиболее пригодны этанол и изопропанол, в меньшей степени – ацетон. Так, часто используют осаждение ферментов изопропанолом (рис. 11.2). Процесс протекает при сравнительно низкой концентрации (52–53 %), и готовые препараты содержат на 40–45 % меньше балластных веществ, чем при осаждении ацетоном и этанолом.
Присутствие электролитов. Наличие в растворе некоторых катионов может оказывать стабилизирующее влияние на фермент. Так, ионы Ca2+ способствуют сохранению активности α-амилаз, протеиназ, глюкоамилаз; защитным действием обладают ионы магния, марганца, кобальта. В то же время ряд ионов (Fe2+, Pb2+, Cu2+ и др.) действует в плане активности, наоборот, отрицательно, и присутствие их нежелательно. Наличие электролитов позволяет снизить расход осадителя и улучшить структуру осадка.
Температура ферментного раствора и растворителя. При осаждении ферментов следует стремиться, чтобы температура, по возможности, была низкой. Смешивание спирта и водного раствора фермента сопровождается выделением тепла, и, если спирт не охлажден, происходит инактивация ферментов. Для большинства ферментов, получаемых в промышленных условиях, оптимальная температура осаждения равна 3–5 ºC. Для достижения этой температуры раствор фермента охлаждают до 1–3 ºC, а растворитель – до 8–12 ºC.
рH среды. Ферменты наиболее полно осаждаются в изоэлектрической точке. Использование органических растворителей при pH, близком к изоэлектрической точке, позволяет ускорить осаждение ферментов и использо- вать меньшее количество растворителя.
Концентрация сухого вещества в исходном растворе. Максимальный выход активного фермента в препарат и наиболее стабильная структура осадка наблюдаются при содержании сухого вещества не более 10 % (рис. 11.3).
Длительность контакта с растворителем. Время контакта с растворителем следует сократить до минимума, чтобы предотвратить инактивацию ферментов. Это достигается путем использования непрерывных осадителей.
Рис. 11.3. Влияние исходной концентрации сухого вещества в ферментном растворе на полноту осаждения ферментов: 1 – концентрация спирта 63 %; 2 – 72 %; 3 – 79 %; 4 – 82 %