Топологічні проблеми, пов'язані з реплікацією

Ще одним невід'ємним елементом системи реплікації є ДНК-топоізомерази (див. розділ 3). Рух реплікативної вилки з одночасним руйнуванням подвійної спіралі супроводжується прокруткою спіралі, що створює позитивні надспіральні витки – еластичні напруження попереду від вилки (див. рис. 3.24). Це стосується як еукаріотичних систем, де петлі ДНК зачеплені своїми кінцями за ядерний матрикс, так і прокаріотичних циркулярних хромосом: зустрічний рух двох реплікативних вилок (рис. 9.3) створює позитивні напруження на ділянці, яка ще не є реплікованою. Еластична напруга має час від часу зніматися, інакше в решті решт вона повністю зупинить рух реплісоми. Відповідно, процес реплікації потребує допоміжної дії топоізомераз, основна функція яких як раз і полягає у релаксації надспіралізованої ДНК: штучне вимикання активності топоізомераз повністю блокує реплікацію.

В еукаріотичній клітині завдання релаксації можуть виконувати як топоізомерази І, так і топоізомерази ІІ. Прокаріотична топоізомераза І (топоізомераза Іа) не підходить для виконання цієї ролі, оскільки здатна знімати тільки негативну надспіралізацію. Релаксація позитивної надспіралізації при реплікації у бактерій забезпечується гіразою – ферментом, що відноситься до класу топоізомераз ІІ. Гіраза вносить негативну надспіралізацію в циркулярну ДНК, що й компенсує позитивні напруження.

Рис. 9.17. Термінація реплікації у циркулярному репліконі.

Ще одна топологічна проблема виникає при закінченні процесу реплікації у циркулярному репліконі. Коли дві реплікативні вилки зустрічаються, вони зупиняються за кілька витків подвійної спіралі одна від одної: еластичну напругу на маленькій ділянці зняти вже неможливо (рис. 9.17). Відбувається руйнування короткої подвійної спіралі, яка не піддалася реплікації, але це неможливо зробити без відповідного перекручення двох дочірніх кільцевих молекул ДНК десь у іншому місці. Одноланцюгові прогалини далі заповнюються ДНК-полімеразами. Але після цього дві остаточно синтезовані циркулярні молекули так і залишаються топологічно зачепленими одна за одну – утворюється так званий катенан (рис. 9.17). Таке саме перекручення двох дочірніх молекул ДНК реалізується при закінченні реплікації на двох сусідніх еукаріотичних репліконах (див. рис. 9.2).

Зрозуміло, що декатенація – розділення двох молекул – є неможливим без дволанцюгового розриву в одній з них. За цю операцію також відповідають топоізомерази класу ІІ (еукаріотична топоізомераза ІІ, яка зв'язана з ядерним матриксом під час реплікації, та гомологічна до неї топоізомераза ІV у прокаріотів), що роблять тимчасовий дволанцюговий розріз.

Ініціація реплікації у бактерій

Рис. 9.18. Ініціація реплікації у E.coli. Жовтим позначено 13-мерні ділянки ДНК зі зниженою стабільністю.

Сайт ініціації реплікації E. coli – ориджин oriC – є ділянкою довжиною 245 пар основ, яка містить 4 сайти по 9 пар основ кожний, що мають спорідненість до білка DnaA, а також кілька АТ-збагачених ділянок по 13 пар основ зі зниженою стабільністю подвійної спіралі. Передумовою ініціації реплікації є створення за рахунок активності гірази певного рівня негативної надспіралізації у циркулярній хромосомі. По-перше, негативна надспіралізація сприяє локальному руйнуванню подвійної спіралі у межах ориджина. По-друге, оскільки введення надспіралізації є можливим тільки за умови цілісності полінуклеотидних ланцюгів (хоча б один одноланцюговий розрив знімає будь-яку еластичну напругу), це є ефективною перевіркою готовності матриці (по всій довжині) до реплікації.

На першій стадії ініціації кілька копій DnaA (у комплексі з АТР) зв'язуються з ориджином (рис. 9.18) та індукують АТР-залежне локальне плавлення подвійної спіралі. Білок DnaС завантажує на одноланцюгові ділянки геліказу DnaВ, яка, у свою чергу, рекрутує праймазу та інші елементи реплісоми. Праймаза здійснює синтез праймерів на лідуючих ланцюгах і замінюється на ДНК-полімеразу ІІІ: починається рух двох реплікативних вилок у протилежних напрямах. Напрям руху задається напрямом транслокації гелікази по ланцюгу, що запізнюється. Присутність гелікази саме на цьому ланцюзі забезпечує рекрутування до нього праймази під час елонгації реплікації на початку синтезу кожного фрагмента Оказакі.

На діаметрально протилежному по відношенню до oriC боці циркулярної хромосоми розташовані 6 ділянок по 22 пар основ – сайтів термінації реплікації (Ter A, B, C, D, E, F), що утворюють комплекс з білком Tus (Terminus utilization substance). На сайтах термінації, зв'язаних з цим білком, реплікативні вилки зупиняються. Зона між ними піддається далі локальному плавленню, і відбувається добудова прогалин та декатенація (див. рис. 9.17).