Аналіз експресії геному

Проаналізувати повну програму транскрипції організму чи клітин певного типу при певних фізіологічних умовах або у процесі розвитку, а також вирішувати інші завдання, пов'язані з вивченням функціонування цілого геному, дозволяють методи, що базуються на використанні так званих ДНК-мікроареїв (DNA-microarrays) або ДНК-чіпів (DNA-microchips).

Рис. 11.14. Аналіз сумарної мРНК за допомогою ДНК-мікроарея.

Фрагмент ДНК довжиною до 1000 пар основ, для якого відомо його розташування в геномі, ампліфікується, й одноланцюгові продукти ампліфікації пришиваються до невеликої зони на поверхні предметного скла мікроскопа. Скло розміром 2×2 см – ДНК-мікроарей – покрито сіткою ~6000 таких мікроплям, кожна з яких містить ДНК певної геномної ділянки. На поверхні ДНК-чіпів синтезуються короткі (до 20 нуклеотидів) олігонуклеотиди: кілька олігонуклеотидів, що походять з однієї ділянки геному, синтезуються поряд, і таким чином, невелика зона містить ДНК, комплементарну до індивідуальної геномної ділянки.

Одну з типових схем використання мікроарея зображено на рис. 11.14. Сумарна мРНК, отримана з клітин певного типу, використовується як матриця в реакції зворотної транскрипції. Поряд зі звичайними, до реакційної суміші додається флуоресцентний аналог одного з NTP. У результаті маємо препарат флуоресцентно-міченої кДНК. Після гібридизації з цією кДНК мікроарей аналізують за допомогою флуоресцентного мікроскопа: наявність флуоресцентної плями свідчить про активність певного гена, інтенсивність флуоресценції – про рівень цієї активності.

Експерименти такого типу дозволяють з'ясувати зміни загальної програми експресії генів при змінах зовнішніх умов, активність різних генів у різних тканинах багатоклітинного організму, зміни активності груп генів у процесі диференціювання клітин. Техніка ДНК-мікроареїв широко використовується також у дослідженнях ДНК-білкових взаємодій.

Методи дослідження ДНК-білкових взаємодій

Вивчення тонких механізмів білково-нуклеїнових взаємодії є здебільшого доступним для різноманітних фізичних методів (див. нижче). У цьому підрозділі описано підходи, що дозволяють встановити сам факт взаємодії та з'ясувати локалізацію певного білка на ДНК in vitro та in vivo.

Гель-електрофорез білково-нуклеїнових комплексів

Оскільки рухливість макромолекул при електрофорезі залежить від їх маси та форми, легким засобом встановити факт зв'язування певного білка з певним фрагментом ДНК є так званий шифт-тест (shift assay). Принцип методу є дуже простим: ДНК-білковий комплекс (якщо він утворюється) суттєво гальмується у гелі у порівнянні з вільною ДНК, що призводить, як правило, до наявності двох смуг міченої ДНК після електрофорезу (рис. 11.15, а).

Рис. 11.15. Гальмування рухливості ДНК-білкового комплексу при гель-електрофорезі (а) та залежність ступеня гальмування від позиції білка на ДНК у випадку вигину ДНК на поверхні білка (б).

При цьому, якщо білок, як це часто буває, вигинає ДНК у сайті взаємодії, рухливість комплексу буде залежати від позиції білка на фрагменті ДНК: максимальну рухливість мають комплекси, у складі яких білок розташований на одному з кінців фрагмента, мінімальну – ті, де білок займає центральну позицію (рис. 11.15, б). Причиною цієї закономірності є те, що більш довгі (і тому більш рухливі) кінцеві ділянки вільної ДНК легше проходять через пори геля. Відповідно, це дозволяє оцінити локалізацію білка відносно кінців фрагмента ДНК або розділити комплекси, що розрізняються за такою локалізацією,