Футпринтинг

Рис. 11.16. Футпринтинг ДНК у складі білково-нуклеїнового комплексу.

Іншим підходом, що використовується для точної локалізації білка на фрагменті ДНК, є так званий футпринтинг ДНК (DNA footprinting). Принцип методу схематично зображено на рис. 11.16. Кінець одного з ланцюгів мітять радіоактивною міткою. Зазвичай ³²Р у складі фосфатного залишку приєднується до попередньо дефосфорильованих 5'-кінців полінуклеотид-кіназою, після чого один з кінців фрагмента відрізається рестриктазою (аналогічно до відповідного етапу процедури на рис. 11.12). Якщо внести у цю ДНК обмежену кількість одноланцюгових розрізів (наприклад, один розріз на фрагмент у середньому), отримаємо випадковий набір мічених фрагментів різної довжини, який можна розділити за допомогою гель-електрофорезу в денатуруючих умовах. У якості агентів, що вносять розриви, найчастіше використовують ДНКазу І або гідроксил-радикали: обидва агенти розрізають один з ланцюгів ДНК через маленький жолобок. У випадку, коли з фрагментом ДНК взаємодіє білок, ДНК виявляється захищеною в сайті взаємодії: відповідно, на гелі після електрофорезу можна побачити зону, де відсутні смуги ДНК, або інтенсивність смуг є нижчою у порівнянні з контрольним результатом деградації вільної ДНК. Довжини верхньої та нижньої смуг, що оточують цю зону, дають границі сайту взаємодії відносно мітки.

Аналогічний підхід у комбінації з блот-гібридизацією (так зване непряме кінцеве мічення) дозволяє встановити ступінь захищеності ДНК білками у конкретних геномних зонах. Першим етапом процедури є обмежена деградація ДНК нуклеазою у клітинних ядрах. Після цього виділяють сумарну ДНК і обробляють її рестриктазою: у результаті препарат містить фрагменти ДНК від рестриктного сайту до місця розрізу нуклеазою. Усі ці фрагменти розділяють шляхом електрофорезу, здійснюють блотинг і обробляють нітроцелюлозний фільтр радіоактивно-міченим зондом до певної ділянки генома. На авторадіограмі візуалізуються (або ні, якщо ДНК захищена білком) фрагменти ДНК з цієї зони.

Імунопреципітація хроматину

Метод імунопреципітації (ChIP – Chromatin ImmunoPrecipitation) є потужнім засобом встановити наявність білка на певній ділянці ДНК in vivo (рис. 11.17). Для цього клітини обробляють формальдегідом з метою ковалентного пришивання усіх білків до ДНК. Далі здійснюють лізис клітин, виділяють ДНК та частково її фрагментують. Ковалентні ДНК-білкові комплекси осаджують антитілами, специфічними до конкретного білка (або пропускають через колонку, на якій імобілізовані антитіла). Отримані комплекси руйнують, видаляючи зшивку хімічним шляхом, і аналізують ДНК, яка була зв'язаною в клітині з даним білком.

Одним з варіантів аналізу може бути ампліфікація ДНК за допомогою ПЛР та наступне секвенування або гібридизація з міченим зондом. Якщо, наприклад, зробити зшивку в різні моменти після регуляторного сигналу, то можна встановити послідовність зв’язування білків з регуляторними ділянками промотора певного гена.

Рис. 11.17. Імунопреципітація хроматину.

Якщо білок має численні сайти взаємодії у геномі, до усіх отриманих фрагментів ДНК пришивають промотор РНК-полімерази бактеріофага Т7 і за допомогою полімерази здійснюють транскрипцію in vitro – синтез РНК-копій фрагментів. Далі використовують ці РНК як матриці для зворотної транскрипції у присутності флуоресцентного аналогу одного з NTP і отримані флуоресцентно-мічені кДНК гібридизують з ДНК-мікроареєм, з'ясовуючи рівень присутності білка у різних ділянках геному.

Фізичні методи дослідження структури та активності біомакромолекул

Широке застосування в молекулярній біології мають різноманітні фізичні методи, важливість яких важко переоцінити. Детальний розгляд принципів, іноді досить складних, фізичних методів дослідження структури та функціонування біополімерів та їх комплексів виходить за рамки цієї книги. Нижче дано перелік основних таких методів із зазначенням деяких їх особливостей та характеру інформації, яку можна отримати за їх допомогою.

Методи безпосереднього спостереження

Історично першим методом спостереження досить великих макромолекулярних комплексів із роздільною здатністю у нанометровому діапазоні стала електронна мікроскопія. Зразок розміщується у вакуумній камері мікроскопа, опромінюється променем електронів, який далі проектується на флуоресцентний екран. Зразок при цьому має бути “зафарбований“ певною речовиною, непрозорою для електронів.

Одна з поширених технік полягає в тому, що макромолекули наносять на карбонову підкладку, що є практично прозорою для електронного променя (як і макромолекули), і фіксують на ній. Далі підкладку промивають розчином солі важкого металу (наприклад, уранілацетатом). Після висушування така підкладка стає непрозорою для електронів скрізь, крім ділянки, де розміщена макоромолекула, і уранілацетат не зв'язався з підкладкою. Така техніка негативного контрасту дозволяє спостерігати під електронним мікроскопом, наприклад, молекули ДНК, комплекси ДНК з білками (такі як нуклеосоми), мультибілкові комплекси тощо. Практично, розділення при негативному контрасті лімітоване розміром частинок важкого металу.

Важливим варіантом електронної мікроскопії, який дозволяє уникнути фіксації та контрастування зразка, є кріоелектронна мікроскопія. Тонкий шар (~100 nm) розчину макромолекул на підкладці швидко заморожується до –160°C і при цій температурі розміщується в охолодженій вакуумній камері мікроскопа. Виявляється, що такі зразки дають достатньо високий рівень контрасту без додаткової обробки. Кріоелектронна мікроскопія зіграла важливу роль, зокрема, у дослідженнях структури та механізмів функціонування рибосоми.

Рис. 11.18. Принцип мікроскопії атомних сил (AFM).

Сучасною альтернативою електроної мікроскопії є мікроскопія атомних сил (AFM – Atomic Force Microscopy). Макромолекули адсорбуються на підкладці, після чого зразок може бути дослідженим як після висушування, так і у випадку, коли залишається шар рідини. Підкладка сканується голкою з надзвичайно тонким вістрям, яке, за рахунок міжатомних (вандерваальсових) сил, взаємодіє з поверхнею, відслідковуючи її “ландшафт“. Рух голки реєструється оптичною системою (лазерний промінь, що віддзеркалюється від голки на фотодіод), і перетворюється комп'ютером у зображення поверхні. Роздільна здатність є порівняною з такою електронного мікроскопа, але, на відміну від електронної мікроскопії, AFM не потребує фіксації та контрастування зразка, дозволяє працювати з макромолекулами, що знаходяться в умовах, близьких до фізіологічних. Крім того, існує можливість кількісної оцінки висоти зміщення голки відносно поверхні підкладки.