Методы исследования
Современная биохимия для исследования патологии на животных может использовать любой современный биологический, химический, физический, математический и другие методы. Описание методов исследования, используемых в клинической лаборатории, в том числе биохимических, можно найти в любом справочнике по клинической лабораторной диагностике. Далее приводится далеко не полный список методов, прошедших настройку и апробацию в условиях нашей кафедры:
Гематологические показатели: содержание ретикулоцитов, гемоглобина, лейкоцитарная формула [7]
Состояние пролиферативных процессов: морфология костного мозга, проточная ДНК-цитометрия, включение 3Н-тимидина в ДНК[21].
Проницаемость, вязкость клеточных мембран миелокариоцитов: in vitro включение 3Н-тимидина, 14С-холестерина [18,21].
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) в периферической крови и тканях: хемилюминесценция (ХЛ), индуцированная 3 % перекисью водорода диеновая конъюгация высших ненасыщенных жирных кислот, накопление малонового диальдегида (МДА) [31, 34].
Антиокислительная активность (АОА): активность пероксидазы, каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы, концентрация мочевая кислоты, церулоплазмина, метгемоглобина по стандартным методам [3, 11,].
Важнейшие субстраты и метаболиты: концентрация общих липидов, фосфолипидов, общего белка и их отдельных фракций в сыворотке крови и органах.
Резистентность эритроцитов: перекисная, осмотическая (ПРЭ и ОРЭ) [11, 26].
Активность ферментов глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6 – фосфоглюконатдегидрогеназы, катепсина, ДНК-азы, РНК-азы, кислой и щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, сукцинатдегидрогеназы и др[ 11,12, 26, 31,].
Статистическая обработка результатов: t-критерий Стъюдента, непараметрические критерии, коэффициент корреляции (r) по параметрическим критериям[6, 8, 12, 17, 23, 30 ].
Для оценки состояния процесса в пределах курсовой работы будет достаточно 2-3 параметров, адекватно отражающих его протекание в организме. Так, например, для характеристики активности лизосомального аппарата исследуют из 70 известных ферментов только так называемые маркерные энзимы: ДНК-азу, РНК-азу, кислую фосфатазу и катепсин Д [26].
С одной стороны, следует стремиться к комплексной и всесторонней оценке с помощью выбранных методов исследования изучаемых параметров, с другой стороны – выбирать наиболее информативные методы. Поэтому, как правило, в пределах курсовой работы одному студенту будет трудно использовать более 3-4 методов исследования одновременно.
Подготовка реактивов, биопроб и работа с оборудованием
После того как выбраны методы исследования, следует приступить к их освоению. Имея план исследования, следует сосредоточить на лабораторном столе необходимые емкости для жидкостей и подобрать к ним пробки (обратить внимание с учетом затрат реактивов на каждый опыт на их емкость и последующий способ хранения), пробирки и колбы, мерные пипетки и мерную посуду, штативы, химические реактивы и т.д.
Первым требованием при подготовке биохимического исследования является чистая посуда. Существует несколько способов ее мытья. Мытье с помощью стирального порошка. Небольшое количество стирального порошка (1 столовая ложка) растворяется примерно в 10 литрах теплой воды, вся посуда погружается в нее так, чтобы жидкость заполнила внутреннее пространство сосудов, и оставляется на несколько часов . После этого каждый предмет (пробирка, колба, флакон и т.д.) тщательно моется с помощью лабораторного ершика или кусочка марли на корнцанге изнутри и снаружи. Для очистки сильно загрязненных участков необходимо использовать сухой стиральный порошок и струю проточной воды. Затем сосуд ополаскивается 6-8 раз, после чего дважды или трижды ополаскивается дистиллированной водой и помещается в сушильный шкаф. Критерием хорошо промытого сосуда является равномерное стекание воды по его стенкам. Температура сушки устанавливается около 200 градусов Цельсия. Процесс сушки длится несколько часов или до следующего дня. Лабораторная посуда может быть заготовлена впрок на весь эксперимент или его часть. Она должна храниться в чистом сухом закрытом пространстве без доступа пыли, например в шкафу.
Внимание! Резиновые трубки, пробки, полиэтиленовые сосуды должны сушиться при комнатной температуре во избежание расплавления и изменения объема. Мерная посуда (пипетки, цилиндры, мерные колбы и др.) также сушатся при комнатной температуре [2 , 24 ].
Для мытья пипеток их помещают в мерный цилиндр емкостью 500 мл или 1 литр и заливают раствором стирального порошка. Дальнейшее мытье состоит в прокачивании этого раствора через пипетки с помощью резиновой груши. Затем с помощью груши их последовательно 6-8 раз промывают теплой водопроводной водой и 2-3 раза дистиллированной. Сушка осуществляется при температуре не выше 45 градусов или продувкой воздухом.
Все реактивы готовятся на дистиллированной или бидистиллированной воде. Для приготовления раствора с известной процентной концентрацией (массовой долей вещества) из расчета 100 г раствора надо взять навеску реактива и добавить объем воды, соответствующий недостающей массе реактива до 100 г.
Если необходим раствор с заданной молярной концентрацией, следует знать его молекулярную массу. Молекулярная масса в граммах будет равна 1 молю вещества, а если это количество вещества довести растворителем до 1 литра, то молярная концентрация составит 1 моль/литр.
Нормальная концентрация (нормальность) – это молярность, поделенная на валентность анионной или катионной частей молекулы. Если число г вещества, равное его нормальности, растворить в одном литре раствора, то полученная концентрация будет 1-нормальной. Другие способы выражения концентрации используются реже.
Если на эксперимент потребуется большее количество реактива и он хорошо хранится при комнатной температуре или в холодильнике, необходимо сделать его сразу больше. Следует обратить внимание на способ хранения: температуру, допустимость хранения на свету, возможность доступа воздуха. Например, трансформирующий раствор для определения концентрации гемоглобина используется в количестве 5 мл на одну пробу. Если предстоит обработать около 200 проб за весь период выполнения курсовой работы, то необходимо приготовить его сразу в объеме 1 литра и хранить при комнатной температуре во флаконе из темного стекла 2-3 месяца. При этом он не потеряет своих свойств.
Для хранения растворов, содержащих органические растворители, следует использовать только склянки с притертыми (стеклянными) пробками или с корковыми пробками обернутыми пищевой фольгой. А вот использовать фольгу на пробки для хранения растворов кислот и щелочей не допустимо. Растворы биопрепаратов, как правило, готовят непосредственно перед опытом, всякий раз заново делая навеску, или некоторое время хранят в морозильнике холодильника в замороженном состоянии. Это касается растворов гемоглобина, ферментативных препаратов, белков и др.
Флаконы с реактивами должны быть снабжены четкими надписями о содержимом, его концентрации и - иногда - для скоропортящихся растворов – о времени приготовления [ 2, 32, 34].
Предметные стекла для гистохимических исследований готовятся следующим образом: очищенные от нежировых загрязнений стекла заливают на 1 сутки реактивом Блюра, представляющий собой смесь этилового спирта и диэтилового эфира в соотношении 3:1, затем извлекаются пинцетом и сушатся на фильтровальной бумаге при комнатной температуре, после этого складываются в коробку для хранения [12].
Наиболее ответственным этапом является получение и подготовка биоматериала от лабораторного животного. Как правило, после забоя животного под эфирным рауш- наркозом следует извлечение и измельчение органов для биохимических исследований. Например, печень экспериментальных животных после забоя перфузируется холодным физиологическим раствором через канюлю, введенную в заднюю полую вену, с целью удаления из сосудов органа периферической крови. Затем одну из долек печени извлекают из организма и пропускают через охлажденный пресс с диаметром отверстий 0,7 мм. Полученную тканевую кашицу взвешивают на весах и суспендируют в забуференном физиологическом растворе в соотношении 1 г сырой массы органа на 5 мл раствора.
Гомогенизацию клеточной массы с целью разрушения клеток производят в гомогенизаторе Поттера-Эльвегейма (стекло-тефлон) с электроприводом при 3000 об/ мин. на ледяной бане в течение 2 минут или в отдельных исследованиях в течение 10 секунд на ультразвуковом диспергаторе УЗД-1 при таком же способе охлаждения. Полученный гомогенат фильтруют через капроновую ткань и до исследования хранят на холоду [ 3, 9, 20, 21, 36 ].
Следующим важным этапом освоения методики является ее «прогонка» с использованием биоматериала от животных или человека. Если метод является общепринятым, то необходимо сопоставить получившийся результат с установленной для этого метода нормой. Рабочей методику можно признать только тогда, когда она дает хорошо воспроизводимый относительно стабильный результат. Для большинства биохимических методов погрешность, как правило, не превышает 5-7 %. Современные методы исследования имеют стандартную погрешность, которая указывается в их описании. Если погрешность существенно превышает допустимую, следует работать в направлении устранения нежелательных влияний: колебания температуры, освещенности, нарушений временных интервалов, влияния примесей и т.д., а также отрабатывать технику исследования. Идеальным вариантом проверки работоспособности методики является проверка на экспериментальной модели, для которой изменение изучаемого параметра заранее известно. Если в результате последовательного воспроизведения методики получается один и тот результат (отсутствует разброс данных в пределах допустимых норм) или получаются цифры отличающиеся друг от друга в несколько раз или на несколько порядков, то это говорит о том, что методика не дает возможности адекватно оценить исследуемый параметр. В этом случае необходимо еще раз внимательно перечитать текст методики, найти этот же метод в другом литературном источнике, проверить правильность приготовления реактивов и каждый этап методики. В случае, если ошибка не найдена, следует посоветоваться с преподавателем.
Для исследовательской работы используется разнообразная аппаратура, перед работой на которой следует внимательно ознакомиться с соответствующими инструкциями и прослушать информацию преподавателя о правилах работы. Все электроприборы должны быть заземлены, иметь исправную электропроводку для включения в сеть. На время работы с них следует снять пылезащитный чехол и не забыть по окончании работы после отключения от сети надеть его обратно. Во время работы на приборах запрещается прикасаться к ним мокрыми руками, держаться одновременно за прибор и трубы водопровода, центрального отопления и другие токопроводящие предметы. Не следует также класть на электроприборы лабораторные журналы, ставить реактивы, клетки с животными. При работе с микроскопами с особой осторожностью нужно относиться к оптической их части: не допускать соприкосновения объектива с предметным стеклом и препаратом, оберегать линзы от других механических воздействий, после работы с иммерсионным маслом следует тщательно протереть объектив кусочком мягкой чистой, слегка смоченной в спирте или ксилоле, ткани. При работе с электрическими приборами, как правило, требуется некоторое время для их прогрева после включения в сеть (до 30 мин.). Если у фотоэлектроколориметра, спектрофотометра или хемилюминометра открывают кюветную камеру для помещения образца в кювете, то предварительно обязательно закрывают шторку фотоэлемента, если конструкция прибора не предусматривает ее автоматическое закрытие, во избежание «травмы» светом фотоэлемента. С особой осторожностью следует обращаться с кюветами данных приборов. Брать руками их следует только за торцевую часть (через которую не будет проходить луч оптического прибора или свечение образца). После работы кювету необходимо тщательно промыть – сначала под проточной водой, а затем 2-3 раза ополоснуть дистиллированной, протереть снаружи фильтровальной бумагой и поместить в футляр. Ни в коем случае кюветы со следами влаги нельзя оставлять в кюветной камере приборов во избежание процессов коррозии и повреждения фотоэлементов [2,9, 20, 24].
Для расчетов концентрации веществ в фотометрических исследованиях используется закон Ламберта-Бера:
,
где Е – экстинция, е – коэффициент молярной экстинции, (в см - 1 х М – 1 ), L – толщина оптического слоя в кювете в см, С – молярная концентрация раствора, k – коэффициент разведения, рассчитываемый отдельно для каждого метода. При наличии определяемого вещества в чистом виде возможно построение калибровочного графика или выведение расчетного коэффициента [20, 21].
При использовании центрифуги следует обратить внимание на то, чтобы пробирки, помещенные в ротор, были уравновешены по массе на специальных весах, установлены симметрично относительно оси вращения, крышка плотно закрыта. Следует учитывать при центрифугировании материал, из которого изготовлены пробирки: стеклянные тонкостенные выдерживают центрифугирование в режиме не более 2-3 тысяч оборотов в минуту, толстостенные – до 8-9 тысяч оборотов в минуту, при числе оборотов выше 9 тысяч следует пользоваться пластмассовыми пробирками. «Разгонять» ротор центрифуги до необходимого числа оборотов следует постепенно, во избежание выплескивания материала из пробирок, останавливать медленно, чтобы сохранить целостность осадка. Пред началом центрифугирования следует осмотреть пробирочные гнезда в роторе – они должны быть чистыми и сухими, не содержать посторонних предметов (например, стекло разбившихся ранее пробирок) [2, 20, 24].
При центрифугировании проб, содержащих летучие соединения, пробирки закрывают кусочком пищевой фольги. Как правило, центрифуги не нуждаются в прогреве перед работой. Если же в методике указана температура центрифугирования, как правило в диапазоне 0 – 4 градусов, что необходимо для сохранности биоматериала, то необходимо заблаговременное (за 15-25 минут) включение рефрижератора.
При пользовании электронагревательными приборами следует придерживаться правил пожарной безопасности: под горящую спиртовку или электроплитку необходимо подкладывать лист негорючего материала (асбест, мрамор и т.д.), вблизи не должны находится горючие вещества, следует избегать ношения в лаборатории одежды из горючих синтетических материалов. Исследователь должен знать расположение приспособлений для тушения пожара (огнетушитель, пожарные краны, песок, асбестовые полотенца), а также иметь доступный телефонный аппарат, снабженный трафаретом: “При пожаре звонить - 01”
При проведении процессов термостатирования можно пользоваться термостатами и ультратермостатами. Термостаты способны поддерживать заданную температуру проб с относительно большими колебаниями (при открывании дверцы воздух поступает из помещения внутрь прибора). Поскольку нагревательным материалом для проб служит воздух термостатной камеры, то и прогрев проб осуществляется медленно. Водяные ультратермостаты лишены этих недостатков, однако более сложны в эксплуатации [2, 20, 24 ].
Более подробно ознакомиться с правилами работы на исследовательской аппаратуре можно по инструкциям к соответствующим приборам.
Все манипуляции с легко испаряющимися, ядовитыми и особо токсичными соединениями следует производить с особой предосторожностью, используя вытяжные шкафы, резиновые перчатки, защитные очки или защитный прозрачный щиток на лицо. После попадания на кожу или в глаза щелочей или кислот их следует смыть водой, а затем промыть слабым (1 %) раствором уксусной кислоты и пищевой соды соответственно. Все манипуляции с кислотами и щелочами необходимо производить вблизи водопроводного крана, при растворении их в воде вливать кислоту в воду струйно постепенно без брызг, одновременно перемешивая смесь стеклянной палочкой, следить за температурой раствора, не доводя до закипания [2].
По окончании работы все электроприборы, за исключением термостатов и холодильников, должны быть выключены. Грязная посуда залита водой в емкостях или вымыта, поверхность лабораторного стола вымыта и насухо протерта [2].
В качестве примера приводится описание прибора и исследование хемилюминесценции (ХЛ) на нем. Исследование ХЛ проводили на приборе люминометре 1420.1 c ФЭУ ( фотоэлектронный умножитель ) 140, охлаждаемом протоком холодной водопроводной воды (''Конструктор'', Н. Новгород). Люминометр был соединен через интерфейс с персональным компьютером РГС IBM РС/ АТ 286 с установленной на нем программой ''Диагност'', предназначенной для регистрации и рассчета параметров ХЛ (''Конструктор'', Н. Новгород) ( рис. 3 ). Результаты исследования получали в виде графика зависимости интенсивности свечения от времени, учитывали показатели светосуммы и амплитуды ХЛ, рассчитанные в программе ''Диагност'' (рис. 4). В качестве источника стандартного свечения для тестирования ФЭУ использовали светодиод, дающий сверхслабое излучение в области 400 – 600 нм. Исследование ХЛ проводили на основе методических рекомендаций нескольких групп авторов. Ход работы. 1 мл гомогената миелокариоциов или сыворотки крови вносили в термостатируемую затемненную кюветную камеру люминометра, снабженную мешалкой для перемешивания пробы; прогревали в течение 5 минут до температуры 37 градусов Со; записывали фоновое значение свечения после открытия шторки прибора, разделяющей кювету и ФЭУ; на экране компьютера записывали исходный уровень свечения (спонтанная ХЛ, мало отличимая по значениям от фона). Затем в пробу вводили 0,5 мл 3 % перекиси водорода для стимуляции ПОЛ в стандартных условиях. Вспышку ХЛ и дальнейшую ее динамику регистрировали в течение 180 секунд в виде кривой, отражающей зависимость интенсивности ХЛ от времени. По окончании заданного времени регистрации компьютерная программа ''Диагност'' рассчитывала в относительных единицах величину максимального подъема кривой – амплитуду ХЛ и площадь, ограниченную горизонтальной осью координат и кривой ХЛ – светосумму ХЛ.
Рис. 2 Схема установки для исследования ХЛ
Рис. 3 Параметры ХЛ : h – амплитуда, S – светосумма
Полученные показатели ХЛ соотносили с содержанием в пробе общих липидов, фосфолипидов, общего белка, а для костного мозга – с содержанием в пробе миелокариоцитов. Амплитуда ХЛ отражает в основном содержание в пробе легкодоступных для окисления соединений, светосумма ХЛ – соотношение в пробе про- и антиоксидантов. Уровень свечения биообразца в данный момент времени отражал скорость рекомбинации свободных радикалов[ 3, 21].