Проведение эксперимента

Приступать к проведению собственно экспериментальных исследований можно лишь после успешного окончания подготовительного этапа, когда сформулированы тема, цель и задачи, изучена основная литература по теме, выбраны, настроены и отработаны методы и модель для исследования, оборудовано рабочее место, имеется календарный (временной) план исследования, а если исследователь будет работать не один, то – распределены роли каждого участника в эксперименте.

Прежде чем приступить к эксперименту, необходимо продумать форму записи результатов в лабораторном журнале. Форма журнала может быть произвольной, однако, он обязательно должен содержать тексты методик, расчеты по приготовлению реактивов и доз вводимых препаратов, правила работы на приборах, нумерацию или маркировку животных, список необходимого оборудования, календарный план работы и схему эксперимента. Записывать результаты лучше всего в табличной форме, оставив запасные графы для пометок и расчетов ( таб. 1):

Таблица 1.

Лабораторный журнал (пример)

Воздействие	№ животного	Вес животного	Доза препарата	Дата введения	Дата забоя	Вес органа	Кол-во эритроцитов	Активность каталазы
Контроль	1. 6.
Средние величины
Опыт	7. 12.
Средние величины
Достоверность различий

Результаты экспериментов желательно оформлять не менее, чем в 2 экземплярах (под копирку). Один экземпляр результатов должен храниться на кафедре у научного руководителя. Исключительно удобным является современный способ создания базы экспериментальных данных на ПК в программе “Ехсеl” в виде электронных таблиц. В качестве примера участков электронных таблиц приводятся следующие (таб. 2) [21].

Таблица 2.

Пример электронной таблицы Ехсеl

№ животн	дата	возр.мес.	воздействие	масса в г	кровь ХЛ S	кровь ХЛ h	кост.мозг ХЛ S	к.м. ХЛ
1	19.03.95	20	Кобальт	450	9714	81	2568	30
7	21.03.96	20	Кобальт	500	10120	85	13380	103
13	22.03.96	20	Кобальт	500	11233	95	13360	78
19	26.03.96	20	Кобальт	500	9935	86	15334	148
25	28.03.96	20	Кобальт	430	6821	57	1868	18
31	29.03.96	20	Кобальт	550	8497	75	2531	65
37	04.04.96	18	Кобальт	300	9870	85	7781	128
2	19.03.95	20	физ.р-р	450	8761	73	1682	16
8	21.03.96	20	физ.р-р	450	10506	87	10851	79
14	22.03.96	20	физ.р-р	500	11990	109	8311	90
20	26.03.96	20	физ.р-р	450	9189	78	6677	64
26	28.03.96	20	физ.р-р	500	6788	59	6730	67
32	29.03.96	20	физ.р-р	500	9542	80	6688	127
38	04.04.96	18	физ.р-р	300	9788	83	4463	83

В случае не предусмотренной опытом самопроизвольной гибели животного (группы животных) необходимо поставить в известность научного руководителя и сделать запись в лабораторном журнале с указанием возможной причины гибели.

Наиболее частыми причинами гибели животных при проведении студентами эксперимента являются передозировка препаратов при экспериментальном воздействии, вирусные или бактериальные инфекции, а также переохлаждение в результате нарушений правил содержания животных в виварии.

Трупы погибших животных должны быть исследованы с участием преподавателя, а при массовых падежах – санитарного врача и заведующего виварием.

Не следует помещать в одну клетку животных, отличающихся друг от друга по биологическому виду и возрасту, полу, характеру воздействия или степени его. В этом случае крысы и мыши могут умерщвлять и поедать более слабых животных, особенно если они подвергались оперативному вмешательству, наркозу или сохраняют запах рук экспериментатора. Если в процессе эксперимента студент брал животное в руки, то перед возвращением животного в общую клетку следует протереть шерсть подстилкой из клетки.

Данные проведенного исследования могут считаться достоверными при соблюдении следующих условий: однородность материала, идентичность условий опыта, достаточное количество наблюдений, наличие контрольной группы, использование «слепого» метода в оценке данных, правильность подбора методов математической обработки материалов.

Если экспериментатор имеет дело с большим количеством методов исследования, для которых необходимо соответственно и большое количество биоматериала от одного животного, то при необходимости можно объединять биоматериал в одну пробу от нескольких животных с одинаковой моделью патологии [21].

При недостатке времени для обработки биоматериала от экспериментальных животных по некоторым методикам материал можно консервировать и хранить более или менее продолжительное время. Например, для большинства цитохимических исследований крови допустимо приготовить мазки, зафиксировать их и накапливать до окончания работы с животными, а затем подвергнуть дальнейшей обработке и микроскопированию [12, 34].

В лабораторном журнале в разделе «примечание» следует тщательно отмечать все отклонения от стандартного хода эксперимента, ошибки и дефекты в его проведении с тем, чтобы по окончании работы можно было взять для статистической обработки только те эксперименты, которые выполнены безукоризненно. Это также необходимо для того, чтобы не упустить научные факты, которые на первый взгляд могут казаться нежелательными отклонениями от эксперимента [5].

Экспериментальное исследование может состоять из одной или нескольких серий эксперимента. Как правило, необходимость в проведении двух или более серий опытов бывает тогда, когда либо изначально было поставлено несколько задач, либо когда каждая последующая серия является логическим продолжением предыдущей, подтверждает или опровергает тот вывод, который возник после проведения первоначальных исследований. Например, для того чтобы подтвердить участие эндокринной системы в активации перекисного окисления липидов в системе крови после стрессорного воздействия на организм, что явилось результатом первой серии экспериментов, во второй серии изучалось влияние добавок адреналина к крови in vitro с последующим исследованием параметров перекисного окисления в ней [5,13, 21].

При исследовании стабильных хорошо воспроизводимых показателей, особенно если при этом используются еще и стандартные общепринятые методики, лучше всего обследовать сначала контрольных животных (без воздействия), вычислить нормальные величины изучаемых показателей и пределы их колебаний, а затем опытную группу. Более правильным вариантом, когда мы имеем дело с относительно стабильными параметрами (количество эритроцитов, гемоглобина и др.) нужно поочередно брать в исследование опытных и контрольных животных. Когда же экспериментатор имеет дело с нестабильными параметрами (например, при исследовании ферментативных систем или свободнорадикального окисления) оптимальным вариантом будет отбор в эксперимент одновременно опытного и контрольного животных. Большое значение при проведении исследований имеет время суток и года, температура окружающего воздуха, качество кормления животных. Следует стараться стандартизировать эти условия, иначе в результате эксперимента можно получить информацию не о воспроизведенной вами экспериментальной модели, а о влиянии одного или нескольких вышеперечисленных факторов на животных. Вопросы идентичности животных в экспериментальных группах обсуждались ранее.

Если исследуется влияние какого-либо одного фактора на организм, то необходимо иметь минимум две группы животных: с воздействием и без воздействия. Однако, если контрольной манипуляцией тоже является какое-либо слабое воздействие (инъекция физиологического раствора), то необходимо иметь еще и вторую контрольную группу, которую можно назвать интактной и которая не будет подвергаться никаким воздействиям. В итоге будет получено три результата, являющихся следствием:

1. специфического воздействия препарата + болевого воздействия во время инъекции – опыт,

2. болевого воздействия во время инъекции – контроль,

3. отсутствия воздействия (интактные животные).

Если изучаемый параметр в 1 группе существенно и достоверно отличается от такого же параметра во 2 и 3 группах, значит его изменение обусловлено воздействием изучаемого препарата. Если параметр 1 группы не отличается от параметра 2 группы, но отличается от параметра 3 – значит, на его изменение оказал влияние не исследуемый препарат, а сам факт инъекции и болевое воздействие [5 , 28].

Исследование в клинической биохимии существенно отличается от экспериментальной тем, что для исследования используются не животные, а пациенты. Группы исследуемых формируются по тем же принципам, о которых было сказано выше. Следует отметить, что не допустимо больных и здоровых людей подвергать болезненным манипуляциям для получения материала для исследования, если это не делается одновременно с забором биоматериала в связи с диагностической необходимостью в интересах больного и данное исследование назначено лечащим врачом. Все действия студента, выполняющего курсовую работу с использованием клинического материала, должны быть согласованы с заведующим отделением. Лечащий врач должен быть посвящен в детали исследования. С больным обязательно должна быть проведена предварительная беседа в присутствии лечащего врача о тех исследованиях, в которых он будет участвовать, подчеркнув их необходимость, безопасность для здоровья, важность для медицинской науки воспитания врачей – исследователей [28, 37].

Работать с биоматериалами, полученными от больных или здоровых людей следует во избежании инфекции (СПИД, вирусный гепатит и др.) только в резиновых перчатках, немедленно обрабатывать дезинфицирующими веществами микротравмы на руках, промывать глаза или лицо при попадании на них биоматериала, при дозировании биоматериала резиновыми грушами или автоматическими пипетками не в коем случае не набирать биожидкости в пипетки с помощью рта [16, 19].

Вся лабораторная посуда после экспериментов на биоматериалах человека после окончания работы должна проходить обязательное обеззараживание: после сливания биожидкостей в специальную банку с дез. раствором (сухая хлорная известь, карболовая кислота и др.) посуда замачивается на ночь в 6% растворе перекиси водорода, а на следующий день моется обычным способом в резиновых перчатках и сушится в сушильных шкафах при температуре 220 градусов Цельсия [2, 19].

Рис. 5 Схема оценки перекисного окисления липидов и антиокислительной активности миелокариоцитов при действии на организм экстремальных факторов.

Ж ивотное Кровь на гематологический анализ (гемоглобин,

эритроциты, ретикулоциты, лейкоциты)

Животное + воздействие (гипоксическая гипоксия, постгеморра-

гическая анемия, воздействие кобальтом)

Ж ивотное Кровь на гематологический анализ

З абой животного

Выделение костного мозга Получение сыворотки крови

Приготовление мазков Центрифугирование,

костного мозга выделение миелокарио-

цитов

Гомогенизация

миелокариоцитов

Разведение гомогенатов

до концентрации по

белку 1 мг/мл

Определение:

1. Антиокислительной активности

2. Активности каталазы и пероксидазы

3. Содержания фосфолипидов

4. Концентрации гидроперекисей

5. Интенсивности хемилюминесценции

6. Концентрации общих липидов [21]

В лаборатории, производящей исследования биоматериалов, полученных от человека, до и после работы (во время отсутствия людей) следует на ночь включать бактерицидные лампы [ 18, 19].

При выполнении эксперимента по клинической биохимии необходимо учесть, что, как правило, не удается получить результаты с малым разбросом значений. Это объясняется индивидуальными особенностями людей, находящихся до поступления в стационар в разных условиях, имеющих свои особенности питания, заболеваемости, возраста и массы тела. При формировании исследуемых групп следует стремиться к их максимальной однородности и наибольшей численности вариант в каждой из них. Если для получения достоверных результатов на животных, как правило не требуется более 5-6 особей в группе, то для получения достоверных результатов на пациентах в клинике может потребоваться несколько десятков человек в исследуемой группе [6, 23, ].

Возможности по исследованию биохимических механизмов на больном человеке в силу ряда причин ограничены, но в большинстве случаев дают ценную информацию для практической медицины. Исследования на животных лишены многих ограничений, однако, на этапе интерпретации данных и перенесения их в практику здравоохранения существенно проигрывают исследованиям, выполненным на человеке. В значительной степени исключить эти недостатки помогает сочетание эксперимента на животных и исследований, выполненных на пациентах. Например, изучая биохимические механизмы панкреатитов, исследователь в клинике оценивает состояние поджелудочной железы по содержанию ее ферментов в крови и в кишечном содержимом, а на экспериментальной модели панкреатита на животных – химическими методами активность ферментов в клетках поджелудочной железы забитых животных. Первая и вторая группа данных дополняют друг друга [7, 19 ,21, 22].

Для стандартизованного выполнения всех исследовательских манипуляций необходимо иметь схему опыта. Примером может служить следующая схема ( рис. 5).