Диско-диффузионный метод (ддм)

Для исследования необходимо использовать стандартные питательные среды: отечественные среды АГВ, № 1, № 2; зарубежные - агар Mueller -Hinton 2. Сухая питательная среда АГВ для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используется в соответствии с наставлением по применению. Среды № 1 и № 2 изготовляют в лаборатории по их прописи: среда № 1 - бульон Хоттингера (120-140% аминного азота) -1 л, агар-агар 15 г, натрия фосфат двузамещенный 3 г, рН-7,2-7,4; среда № 2 - мясо-пептонный бульон (1:2) 1 л. агар-агар 15 г, натрия (фосфат двузамещенный 3 г, рН после стерилизации 7,2-7,4. Для гемофильных бактерий, не растущих на указанных средах, дополнительно добавляют 5%дефибринированной или гемолизированной крови. Агар Mueller-Hinton 2 может применяться и для определения чувствительности к сульфаниламидам. Чашки Петри с питательной средой перед употреблением подсушивают в течение 30-40 мин.

Стандартные диски с антибиотиками промышленного производства используются только до истечения срока их годности. После вскрытия флакон с дисками можно хранить в течение недели в рефрижераторе при 10°С.

На поверхность подсушенной питательной среды в чашке Петри наносят 1 мл исследуемой культуры (18-20 - часовой бульонной культуры или стомиллионной суспензии из агаровой культуры), равномерно распределяют путем покачивания чашки и удаляют избыток пипеткой. В экстренных случаях для получения ориентировочных данных допускается непосредственный посев клинического материала. Плотные субстраты (мокрота, гной, кал и др.) должны быть предварительно гомогенизированы (растерты), мочу и экссудат засевают из осадка после центрифугирования. Материал наносят на чашку ватным тампоном. После выделения чистой культуры исследование повторяют уже с ней. После посева чашки подсушивают при комнатной температуре 10-15 мин. Диски с антибиотиками накладывают пинцетом на равном расстоянии друг от друга и на 2 см от края чашки (на 1 чашку не более 6 дисков). При возможности используют для наложения дисков специальное устройство - диспенсер. Чашки сразу ставят в термостат вверх дном и инкубируют при 35-37°С в течение 18-20 ч.

Для учета результатов чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность и освещают настольной лампой под углом 45°. Допускается учет в проходящем свете. С помощью линейки измеряют миллиметры зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр дисков, точностью до 1 мм. Не следует обращать внимание на очень мелки колонии в переделах зоны торможения роста. При нерезко очерченных краях зон или зонах с двойными контурами следует измерять диаметр зоны по наиболее четкому контуру. При наличии больших колоний по периферии зоны граница ее определяется по внутреннему краю этих колоний. Если крупные колонии распределены по всей зоне, то следует проверить культуру на чистоту и испытания повторить.

Оценку результатов проводят по таблице 4 в соответствии с используемой средой и видами бактерий.

Для контроля точности и воспроизводимости результатов, а также качества питательных сред, дисков и методики проводят испытание чувствительности к антибиотикам эталонных штаммов Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus ATCC 25923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853.

минимальная ингибирующая концентрация (МИК) — наименьшая концентрация препарата, тормозящая рост тест-культуры