19. Основные принципы выделения чистых культур микробов, культивируемых на искусственных питательных средах. Этапы выделения чистых культур.

Чистой культурой называется популяция микроорганизмов одного вида, выращенная на питательной среде.

Методы получения чистых культур:

1. из колонии (изолированное скопление микроорганизмов одного вида, выросших на питательной среде в результате размножения одной или нескольких клеток) – механическое разобщение бактериальных клеток

   • посев петлёй, штрихом по Коху

   • посев шпателем, газоном по Дригалю

   • посев осаждением по Коху

   • посев разбрызгиванием

   • посев перемешиванием в расплавленном и остуженном студне

2. путём подавления роста «лишних» микробов

• на избирательных средах

• после прогревания

• после обработки кислотой

• после антибиотиков

• использование фагов

• после проведения через живой организм

Этапы:

1. Исследование материала

• забор, регистрация

• ориентировочная микроскопия с окраской мазка по 9езофи

• посев смеси бактерий на пластинчатый агар

1. Изучение колоний

• изучение культуральных свойств (величина, форма, консистенция, поверхность, край, наличие пигмента, цвет, прозрачность)

• микроскопия с окраской по 9езофи

• посев колонии на скошенный агар.

1. Изучение чистой культуры

• микроскопия с окраской по 9езофи – морфологически и тинкториально однородные клетки

• идентификация

• биохимическая – посев в «пёстрый» ряд

• фагоидентификация

• сероидентификация

Микробиологический метод включает в себя выделение чистой культуры и её идентификацию.

20. Основные принципы выделения чистых культур микробов, культивируемых на живых объектах. Этапы выделения чистых культур. Методы индикации вирусов.

Для культивирования облигатных внутриклеточных паразитов (риккетсии, хламидии, вирусы) используют живые объекты – клеточные культуры, куриные эмбрионы и чувствительных лабораторных животных.

Клеточные культуры подразделяют на неперевиваемые (клетки эпителиальной или соединительной ткани в питательной среде), полуперевиваемые (диплоидные клетки человека) и перевиваемые (в основном опухолевые клетки – постоянное существование in vitro).

Куриные эмбрионы используют в возрасте 8 – 12 дней, они устойчивы к различным воздействиям.

При заражении лабораторных животных недостатком является необходимость последующего заражения клеточной культуры для получения чистой линии.

Методы индикации вирусов:

• гибель или заболевание живой системы

• цитопатическое действие

• реакция гемадсорбции («зонтик» - положительная, «пуговка» - отрицательная)

• обнаружение вирусных включений

• цветная проба

• метод бляшек во флаконе

21. Диагностическое значение экзоферментов прокариот. Диагностическое значение бактериофагов. Методы определения родовой и видовой принадлежности прокариот.

22. Действие физических факторов на микробы. Температурные критерии жизнедеятельности микробов. Механизм устойчивости микробов к высушиванию, излучениям.

Из физических факторов наибольшее практическое значение имеют температура, высушивание, излучения.

В зависимости от температурного режима жизнедеятельности микроорганизмы делятся на три группы:

• психрофилы (оптимум 6 – 20˚С)

• мезофилы (34 – 37˚С)

• термофилы (выше 37˚С, у некоторых – до 80˚С)

Низкие температуры большинство микроорганизмов, в том числе и вирусы, переносит хорошо. Вегетативные клетки бактерий находятся при этом в анабиотическом состоянии. Также хорошо сохраняются культуры микробов и различного рода биологически активные препараты (например, вакцины). Некоторые бактерии остаются жизнеспособными при –190˚C, а бактериальные споры при –250˚C. Высокая температура, как правило, губительно действует на вегетативные формы бактерий и вирусы в результате денатурации белков.

В естественных условиях высушивание оказывает губительное действие на вегетативные клетки многих бактерий, что связано с обезвоживанием их цитоплазмы и повреждением ЦПМ и рибосом. Высушенные споры бактерий сохраняют способность к прорастанию в течение 10 лет, а споры плесневых грибов – до 20 лет. Лиофильная сушка (высушивание в условиях вакуума из замороженного состояния) применяется для хранения микробных культур и биологических препаратов в течение длительного срока без потери их биологических свойств.

Прямые солнечные лучи обладают бактерицидным свойством, которое обусловлено активностью их коротковолновой части – УФ-лучей с длиной волны 254 – 300 нм. Механизм их действия связан с образованием тиминовых димеров в ДНК бактериальной клетки. Бактерии и вирусы также чувствительны к проникающей радиации. Однако они погибают только при облучении сравнительно большими дозами, порядка 44000 – 280000 Р. Эти свойства применяются для стерилизации.